結核分枝桿菌thy A基因突變與對氨基水楊酸鈉耐藥關系的研究

孫勇 洪峰 許紹發 邢青 劉毅 任衛聰 孫照剛 高鐵杰 張治國 易俊莉 王甦民 李傳友

目前，結核病仍是最常見的傳染病之一，全世界約有2億人感染Mtb，其中僅2010年新增880萬患者，140萬人死于結核?。?］。近年來，由于不合理的用藥及新藥研發的緩慢導致 MDR－TB（至少對INH、RFP耐藥的結核?。┗颊叩脑龆嗉敖Y核病防控的困難。2010年我國結核患者中有5.4%為MDR－TB患者［1］。由于Mtb對一線藥物的耐藥，人們開始更多關注二線抗結核藥物，并與一線抗結核藥聯合應用，但隨著應用的二線藥物如氟喹諾酮類藥物、卡那霉素、卷曲霉素等耐藥出現，人們又開始尋找那些對Mtb有抑制或殺滅作用而應用不是很廣泛的藥物，其中對氨基水楊酸鈉（PAS）是重要的二線抗結核病藥物之一，但對其作用機制及耐藥機制尚不十分清楚。

PAS對Mtb有抑制作用，一般認為PAS與對氨基苯甲酸（PABA）近似，通過對葉酸合成的競爭抑制作用而抑制 Mtb的生長繁殖［2］。Rengarajan等［2］在卡介苗菌株中利用轉座子插入的方法，發現編碼胸苷酸合成酶 （thymidylate synthase，thy A）的基因突變抑制了酶的活性導致細胞內葉酸水平的下降，其認為thy A基因突變不僅導致PAS耐藥而且還是其他和葉酸代謝相關藥物的靶點。Ratledge等［3］認為PAS抑制了 Mtb對鐵離子的吸收，從而導致Mtb生長受限及毒力的減弱。由于PAS不是臨床首選藥，應用的相對較少，對其耐藥的研究更少，目前認為thy A基因的突變導致了PAS耐藥［2］。筆者通過全基因測序測定thy A基因，了解65株PAS敏感菌株和31株PAS耐藥菌株thy A基因突變情況，分析了PAS耐藥與thy A基因突變的關系，探討PAS耐藥分子機制，為建立快速耐藥檢測方法及指導臨床醫生合理用藥提供科學依據。

材料和方法

一、材料

1.臨床菌株來源：本實驗所用北京地區96株Mtb臨床分離株來源于2008—2010年北京市結核病控制研究所和北京市昌平區結核病防治所，采集的痰標本按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》［4］進行Mtb的培養、菌種鑒定，采用比例法測定藥物敏感實驗。標準菌株H37Rv（ATCC25618）為本室保存。

2.主要儀器設備：Bio－rad S1000基因擴增儀（美國Bio－rad公司），Fo ToDYNE凝膠成像系統（美國Image公司），Nanodrop2000核酸分析儀（美國Thermo公司），ESCOⅡ生物安全柜（新加坡ESCO公司）。

二、方法

1.細菌基因組DNA的抽提：采用酚/氯仿抽提的方法［5］。

2.PCR 擴增：Primier 5.0設計引物，上游5′GGTGTCGGTGGTTTTCGGCAT3′， 下 游 5′TCAGCCCCACCATCGTCACAC3′，擴 增 全 長1060 bp，其中包含thy A基因（792 bp）。采用50μl體系，包括2×pfu DNA聚合酶（北京Generay公司）25μl，上下游引物各0.4μmol/L，1μl模板，雙蒸水22μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸2.3 min，最后72℃延伸5 min，35個循環。

3.PCR純化：PCR產物置1%瓊脂糖凝膠中電泳，用DNA凝膠回收試劑盒（杭州Axygen公司）回收DNA擴增片段，分別送北京擎科新業和北京金唯智生物科技公司測序。H37Rv的標準序列來自結 核 數 據 庫 網 站［6］。 采 用 DNAMAN Version 5.2.2軟件進行序列比對。

三、統計學分析

數據采用SPSS 10.0進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Mtb培養、鑒定及藥物敏感性實驗結果

分離得到96株痰培養陽性菌株并進行鑒定和藥物敏感性實驗。全部鑒定為Mtb，耐PAS菌株31株（32.29%），敏感菌株65株（67.71%），耐藥與敏感菌株的患者男性與女性差異無統計學意義（χ2＝0.381，P＞0.05）；初治患者中耐藥與敏感菌株分別達到了70.97%、86.15%，但兩者差異無統計學意義（χ2＝3.177，P＞0.05）；同時北京常駐人口與外地流動人員相比較耐藥與敏感菌株差異無統計學意義（χ2＝0.037，P＞0.05）（表1）。

表1 96株Mtb對PAS的藥物敏感性實驗結果 ［株（構成比，%）］

二、PCR擴增結果

96株Mtb經PCR擴增，在1000 bp左右均擴增出清晰條帶，部分結果見圖1。經凝膠回收對PCR產物進行純化，經測序比對后證實包含thy A基因片段。

圖1 thy A基因擴增片段電泳結果

三、序列測定的分析結果

以Mtb標準株H37Rv序列為對照對測序結果進行分析，發現突變類型包括單堿基缺失、堿基的插入、堿基突變。其中以第19位堿基C缺失和第168位堿基C缺失突變為主，在耐藥菌株中的突變率分別是54.84%（17/31）、25.81%（8/31，包括聯合其他位點突變株），但其敏感菌株中突變也達了35.39%（23/65），12.31%（8/65），耐藥與敏感相比兩個位點突變差異均無統計學意義（χ2＝3.268、2.754，P＞0.05）。在31株PAS耐藥菌株中19位缺失C單突變9株、其聯合168位缺失C突變4株，168位缺失C單突變2株，此外188位缺失T突變2株，5株多位點突變均為1株，其余9株（29.03%）耐PAS菌株thy A基因未發生突變；敏感菌中19位缺失C突變最多15株，其聯合168位缺失C突變4株、聯合16位缺失G突變2株、聯合16位缺失G和168位缺失C突變2株，其余突變各1株，此外，PAS敏感菌株中有30株（46.15%）thy A基因發生突變（表2）。

討 論

PAS是最早被使用的抗結核藥之一［7］。盡管發現其對Mtb有抑菌作用，但因其具有腸道不良反應及肝腎損傷，應用的不是很廣泛，并沒有列入常規化療藥物。但隨著大量MDR－TB及常規使用的二線藥物的耐藥出現，PAS又重新被使用。PAS的研究很少，對PAS耐藥的研究更少。Rengarajan等［2］利用轉座子插入的方法在卡介苗中證實了PAS的耐藥和基因thy A的突變有關，隨后他們在8株PAS耐藥臨床菌株中發現有3株菌thy A基因發生突變，其中2株第202位的蘇氨酸被丙氨酸替換（T202A）、1株第222位精氨酸置換為甘氨酸（R222G），而10株敏感菌株沒有突變。Mathys等［8］隨后分析了118株Mtb與葉酸代謝相關的6個基因thy A、dfr A、fol C、fol P1、fol P2、thy X 和 N－乙?；D移酶相關的3個基因nho A、aac（1）、aac（2），他們研究表明dfr A、fol P1、fol P2、thy X 基因的突變和PAS耐藥無關，而fol C、nho A、aac（1）、aac（2）4個基因沒有發現多態性位點，僅thy A基因突變導致了PAS耐藥。其中37%PAS耐藥菌株thy A基因發生了突變，主要的突變位點是T202A。

表2 31株PAS耐藥菌株和65株PAS敏感菌株thy A基因突變情況 ［株（構成比，%）］

本研究中經培養、藥敏實驗鑒定的31例PAS耐藥菌株和65例PAS敏感菌株，在性別、治療情況、地域上差異均沒有統計學意義。其中患者主要以男性初治患者居多，北京市戶籍人口和流動人口患者基本持平。針對其thy A基因測序發現，有22（70.97%）株耐藥菌株thy A基因發生突變，而敏感菌株中也有30（46.15%）株突變，兩者差異有統計學意義（χ2＝5.206，P＜0.05）。而突變主要以19位缺失C、168位缺失C為主，但敏感菌株和耐藥菌株之間差異卻沒有統計學意義，提示突變位點可能是thy A基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，突變位點可能與PAS耐藥無關。本研究的thy A基因SNP位點與之前研究［8－9］并不吻合，表明thy A 基因突變的復雜多變。而此前認為突變熱點的T202A［8］，本研究并沒有發現。因地域或菌株表型的差異，可能其thy A基因突變位點也不同。Feuerriegel等［10］也認為thy A基因T202A突變位點并不是PAS耐藥標志，可能是拉美地中海型菌株特異性突變位點。

本研究數據顯示PAS耐藥菌株與敏感菌株thy A基因突變位點差異沒有統計學意義，PAS耐藥菌株中高達70.97%的菌株發生了thy A基因突變，因此thy A基因突變可能PAS耐藥的靶點，但本研究中并沒有發現特異性的耐藥突變位點。此前國內張宗德等［9］研究也發現thy A基因突變位點比較分散，沒有突變熱點，因此thy A基因突變是否與PAS耐藥相關一直是研究的熱點之一。國外的體外實驗研究證實了基因thy A的突變和PAS的耐藥相 關［2］。Fivian－Hughes 等［11］在 體 內 研 究 證 實thy X基因同樣編碼胸苷酸合成酶，在thy A基因敲除菌中，胸苷酸合成酶活性沒有降低Mtb生長并未受影響，推測是thy X基因編碼胸苷酸合成酶使其保持正常的水平。他們的研究還表明thy A基因的缺失和PAS的耐藥相關。Ulmer等［12］和 Hunter等［13］研究表明thy A、thy X基因可能是潛在的藥物靶點。而Rengarajan等［2］認為thy X基因突變并沒有導致PAS耐藥。不同的研究顯示thy A或thy X基因均可能與PAS耐藥相關。

本研究分析了北京地區的31株PAS耐藥菌株和65株PAS敏感菌株thy A基因突變情況，耐藥和敏感菌株thy A基因的突變比例較高，但并沒發現與PAS耐藥相關的特異性位點，可能與所選樣本較少有關，也可能存在其他耐藥機制，因此還需進一步大樣本的深入研究。研究thy A基因與PAS耐藥的關系，不僅能研究PAS耐藥機制、更好地指導臨床用藥，而且有助于建立快速、準確的耐藥分子鑒定方法。

［1］World Health Organization.（2011）Global tuberculosis control：WHO report 2011.Geneva：Switzerland［2011－12－24］.http：//www.who.int/tb/publications/global＿report/2011/gtbr11＿full.pdf.

［2］Rengarajan J，Sassetti CM，Naroditskaya V，et al.The folate pathway is a target for resistance to the drug para－aminosalicylic acid（PAS）in mycobacteria.Mol Microbiol，2004，53（1）：275－282.

［3］Ratledge C.Iron，mycobacteria and tuberculosis.Tuberculosis，2004，84（1/2）：110－130.

［4］中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006.33－37；49－51.

［5］Parish T，Stoker NG.Mycobacterium tuberculosis protocols.Totowa，NJ：Humana Press，2001：19－30.

［6］Reddy TB，Riley R，Wymore F，et al.TB database：an integrated platform for tuberculosis research.Nucleic Acids Res，2009，37：D499－508.

［7］Lehmann J Determination of pathogenicity of tubercle bacilli by their intermediate metabolism.Lancet，1946，5（6384）：14－15.

［8］Mathys V，Wintjens R，Lefevre P，et al.Molecular genetics of para－aminosalicylic acid resistance in clinical isolates and spontaneous mutants of Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（5）：2100－2109.

［9］張宗德，趙雁林，李自慧，等.對氨水楊酸鈉耐藥與結核分枝桿菌胸苷酸合成酶基因突變的研究.中華結核和呼吸雜志，2007，30（9）：683－685.

［10］Feuerriegel S，K?ser C，Trübe L，et al.Thr202Ala in thy A is a marker for the Latin American Mediterranean lineage of the Mycobacterium tuberculosis complex rather than para－aminosalicylic acid resistance.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（11）：4794－4798.

［11］Fivian－Hughes AS，Houghton J，Davis EO.Mycobacterium tuberculosis thymidylate synthase gene thy X is essential and potentially bifunctional，while thy A deletion confers resistance to p－aminosalicylic acid.Microbiology，2012，158（Pt2）：308－318.

［12］Ulmer JE，Boum Y，Thouvenel CD，et al.Functional analysis of the Mycobacterium tuberculosis FAD－dependent thymidylate synthase，Thy X，reveals new amino acid residues contributing to an extended Thy X motif.J Bacteriol，2008，190（6）：2056－2064.

［13］Hunter JH，Gujjar R，Pang CK，et al.Kinetics and ligandbinding preferences of Mycobacterium tuberculosis thymidylate synthases，Thy A and Thy X.PLoS One，2008，3（5）：e2237.