“紙層析法鑒定酶促轉氨基作用”實驗方法的改進

李鳳鳴 譚秀山 許先查 王 鶴

（1.新疆農業大學動物營養實驗室，烏魯木齊 830052；

2.新疆職業大學烹飪與餐飲管理學院，烏魯木齊 830013）

“紙層析法鑒定酶促轉氨基作用”實驗方法的改進

李鳳鳴1譚秀山2許先查1王 鶴1

（1.新疆農業大學動物營養實驗室，烏魯木齊 830052；

2.新疆職業大學烹飪與餐飲管理學院，烏魯木齊 830013）

試驗比較研究了13種展層劑對氨基酸的分離效果并驗證了其在酶促轉氨基試驗中對氨基酸的分離效果。結果表明展層劑無水乙醇-水-尿素（80：20：0.5，V/V/W）氨基酸分離效果明顯，且無毒害作用，能夠替代傳統試驗中水飽和酚。

展層劑 氨基酸 紙層析

“紙層析法鑒定酶促轉氨基作用”試驗中分離氨基酸時常用的展層劑是水飽和苯酚[1]（水：酚=1：2，v/v），但苯酚揮發性大，具有強烈的刺激氣味，對皮膚、呼吸道有腐蝕作用，危害教師及學生的身體健康。人們也在不斷嘗試新的安全且分辨效果好的展層劑，用于替代水飽和苯酚，但其效果在試驗中表現參差不齊。本文總結了近10年文獻報道中用于氨基酸分離的13種展層劑并對其分離氨基酸的效果進行了試驗。

1 材料與方法

1.1 展層劑的篩選試驗

1.1.1 展層劑的篩選

根據相關的文獻，我們選擇了相應的展層劑進行篩選。展層劑的組成見表1。

1.1.2 試劑 1%（w/v）谷氨酸溶液、1%（w/v）丙氨酸溶液以及谷、丙氨酸混合溶液。

1.1.3 濾紙 將層析濾紙剪裁為5cm× 16cm，備用。

1.1.4 顯色劑 0.1%（W/V）茚三酮的乙醇溶液。

1.1.5 步驟 采用周順伍主編《動物生物化學試驗指導》中紙層析法鑒定酶促轉氨基作用中的上行法。

1.2 展層劑在紙層析法鑒定酶促轉氨基作用中的應用

根據1.1展層劑的篩選試驗的結果，選擇分離效果明顯的展層劑用于紙層析法鑒定酶促轉氨基作用，以驗證展層劑展層效果。

試驗方法及步驟參見周順伍主編《動物生物化學試驗指導》。

1.2.1 酶液制備，取新鮮肝臟5 g，加0.9%NaCl溶液1 ml，在乳缽中研磨，再加0.9%NaCl溶液1 ml，繼續研磨成勻漿，最后加入0.9%NaCl溶液5 ml混勻，3 000 r/min，5 min離心，取上清液，即為肝臟糜提取液（含有轉氨酶）。

1.2.2 取2支試管分別編號為1、2，分別加入20滴肝臟糜提取液，并將1號管在沸水浴中煮沸2 min，以破壞酶活。再分別加入10滴1%谷氨酸溶液、10滴1%丙酮酸溶液、10滴0.1%KHCO3溶液和5滴0.25%溴乙酸溶液，混勻，37°C水浴1 h后加入4滴2%醋酸溶液搖勻并水浴加熱至蛋白質全部沉淀。分別用濾紙過濾，濾液備用。

1.2.3 層析方法同1.1。

1.3 Rf值的計算：按下式計算氨基酸的Rf值

Rf=原點到層析樣品點中心的垂直距離／原點到溶劑最前沿的垂直距離

2 結果與討論

2.1 展層劑篩選的試驗結果

13種展層劑篩選的試驗結果見表2。

由表2可知3號、10號以及13號展層劑均能夠將氨基酸分離，且谷、丙氨基酸分離效果明顯；分離時間分別為57 min、72 min、69 min。

表1 展層劑的組成

表2 展層劑的篩選試驗結果

表3 紙層析法鑒定酶促轉氨基作用的試驗結果

2.2 紙層析法鑒定酶促轉氨基作用的驗證試驗

經轉氨作用后，氨基酸在各種展層劑中的遷移率見表3。

由表3可以看出，3、10、13號展層劑均能有效分離將氨基酸分離，3號、10號以及13號展層劑中谷氨酸、丙氨酸Rf的差值分別為0.26、0.21、0.36，展層時間分別為60 min、68 min、75 min。Rf的差值越大，分離效果越明顯。3號展層劑的分離效果明顯優于10號，但不及13號展層劑，但在分離時間上3號展層劑的展層時間最短。

從展層效果以及展層時間綜合考慮，3號展層劑即無水乙醇∶水∶尿素（80∶20∶0.5，v/v/w）、10號展層劑即無水乙醇∶冰乙酸∶水（50∶1∶10，v/v/v）均能夠替代13號展層劑水飽和苯酚溶液用于分離氨基酸，但3號展層劑替代效果優于10號展層劑。

3 結論

試驗證明，無水乙醇、水、尿素（80∶20∶0.5，V/V/W）能夠有效的替代水飽和酚作為展層劑，并且氨基酸分離效果明顯，層析試驗時間明顯縮短，且無毒害作用。

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