正交超聲法提取魚腥草多糖工藝研究*

羅 馨，趙衛星，溫普紅

（寶雞文理學院 化學化工系，陜西 寶雞 721013）

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb）又名蕺菜、側耳根、魚鱗草等，是三白草科（Saururaceae）蕺菜屬（Houttuynia）多年生草本植物[1]，為我國傳統常用藥物之一。在我國僅有一種，原名“蕺”，始載于《名醫別錄》下品?！侗静菥V目》載：“其葉腥氣，故俗名魚腥草?！眲e名豬鼻孔、雞兒根等?，F代醫學研究表明魚腥草富含人體所需蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵及VC、VE等多種營養成分，同時還含有多糖、黃酮、揮發油類等多種藥用成分，是一種“藥食兼用型”的野生植物，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效[1，2]。主要用于肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、癰瘡腫毒、消癰排濃、殺蟲、消積、健脾、止血。廣泛分布于我國南方各省區。

本研究通過單因素實驗選擇和正交設計法對魚腥草中多糖進行微波提取，以魚腥草中的多糖提取率為指標，分別對料液比、提取溫度、提取時間和提取次數等因素進行考察，優化出微波法提取魚腥草多糖的最佳條件。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

魚腥草購于寶雞醫藥大廈，95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、丙酮均為分析純。

722 N型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；R-1002型旋轉蒸發器（鄭州長城科工貿有限公司）；2NHW-Ⅱ型電子調溫電熱套（鞏義市予華儀器有限公司）；KQ-2200DE型數控超生清洗器（昆山市超生儀器有限公司）；800B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；101-2型電熱恒溫鼓風干燥箱（北京科威儀器有限公司）。

1.2 魚腥草粗多糖的提取

魚腥草60℃干燥后，粉碎過40目篩,精確稱粉4.0g,放入500mL的燒杯中,加一定體積蒸餾水浸泡24h,在一定溫度下，超聲波提取一定時間，過濾，棄去殘渣，超聲波重復提取一定次數，合并濾液后，濃縮，再加用一定80%乙醇去脂肪，靜置沉淀后，將上層懸浮物用離心機離心（4000r·min-1,30min），取出，合并沉淀，將沉淀溶于丙酮中充分洗滌靜置過夜，沉淀再次用無水乙醇中充分洗滌后，靜置，待沉淀完全后將沉淀物置旋轉蒸發儀中加熱至一定體積，經真空干燥得到魚腥草粗多糖[3，4]。

1.3 多糖含量測定方法[5-7]

1.3.1 測定原理 苯酚-硫酸法測定多糖含量[8-9]，其基本原理是蔗糖在濃H2SO4作用下（圖1），分子內脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛，它們能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在490nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定吸光度。本實驗以葡萄糖做標準曲線。此法簡單，試劑便宜,靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的干擾。

圖1 戊糖和己糖脫水反應Fig.1 Dehydration reaction of pentose and hexose

1.3.2 標準曲線的繪制 取20mL刻度試管11支編號，按表1加入溶液和蒸餾水待測定。

表1 苯酚法測定可溶性糖繪制標準曲線的試劑量Tab.1 Drawing standard curve of the amount of reagent in detemination of soluble sugar by phenol method

然后按順序向試管內加入1.00mL濃度為9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5～20s加入5.00 mL濃H2SO4，搖勻。比色液總體積為8.0mL，在室溫下放置30min，比色，以試劑空白為參比，在490nm波長下測定吸光度A，以糖含量為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸見圖2。

圖2 蔗糖標準曲線Fig.2 Standard curve of sucrose

回歸方程為：A=0.0087C-0.0033，R2=0.9999。

1.4 多糖的測定

精確稱取真空干燥恒重后的魚腥草多糖500mg,水溶解后定容到100.0mL容量瓶中,搖勻,作為多糖儲備液。精確量取多糖儲備液2.00mL,定容置250.0mL量瓶中,再分別取2.00mL置25.00mL量瓶中，然后加入4%苯酚溶液1.00mL，搖勻后迅速加入7.00mL濃硫酸，定容，在室溫放置30min，以相應試劑為空白對照，在490nm測定其吸收度。

2 單因素選擇實驗

2.1 料液比的選擇

料液比（m/V）分別為 1∶10；1∶15；1∶20；1∶25；1∶30，提取溫度為 70℃，提取時間均為 30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標準曲線計算結果多糖提取率，結果如圖3所示。

圖3 料液比的影響Fig.3 Effect of material liguid

圖3結果表明，隨著料液比的增加，魚腥草多糖提取率呈現先升高后降低趨勢，當料液比（m/V）為1∶20時，多糖提取率最大為5.22%，當料液比增加時，提取率下降，故選料液比（m/V）為1g∶20mL。

2.2 提取溫度選擇

選擇單因素實驗2.1中的最佳料液比（m/V）為1g∶20mL，分別在 40、50、60、70、80℃ 5 個溫度下提取多糖，提取時間均為30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標準曲線計算結果多糖提取率，見圖4。

圖4 提取溫度的影響Fig.4 Effect of entraction temperature

圖4結果表明，隨著提取溫度的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現先升高后降低趨勢，當提取溫度為70℃，多糖提取率最大為5.22%，溫度高于40℃多糖含量下降，分析原因可能是隨著溫度的升高，魚腥草多糖開始降解以及蛋白質逐漸溶出。另外升高溫度并在長時間浸提條件下可能會影響多糖的生理活性，因此，綜合考慮多糖的提取量及活性等各種因素，選取70℃為適宜的提取溫度。

2.3 提取時間選擇

選擇單因素實驗2.1和2.2中的最佳料液比（m/V）為1g∶20mL和提取溫度70℃，提取時間分別為 10、20、30、40、50min，提取時間均為 30min，提取3次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標準曲線計算結果多糖提取率，結果見圖5。

圖5 提取時間的影響Fig.5 Effect of extraction time

由圖5可見，隨著提取時間的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現升高趨勢，當提取時間30min，多糖提取率最大為5.22%，提取時間在30min后多糖含量反而下降，這說明此時大多數的多糖已經溶出并達到平衡，再延長提取時間對提取多糖不利。因此，提取魚腥草多糖所需的適宜時間為40 min。

2.4 提取次數

選擇單因素實驗2.1、2.2、2.3中的最佳料液比（m/V）為 1g∶20mL、提取溫度 70℃、提取時間 40 min，提取分別為1,2,3,4,5次，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，利用標準曲線計算結果多糖提取率，結果見圖6。

圖6 提取次數的影響Fig.6 Effect of extraction times

圖6結果表明，隨著提取次數的增加，魚腥草多糖同樣提取率呈現升高趨勢，當提取次數3次時，多糖提取率最大為5.22%，隨著提取次數增加，多糖提取率增加不大，為節省資源，魚腥草多糖提取次數選為3次。

3 最佳條件的確定

在單因素選擇實驗的基礎上，多魚腥草多糖提取的工藝條件進行了優化，采用L9（34）正交試驗，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和提取次數（D）4個因素，每個因素選擇3個水平，具體設計見表2，按照實驗部分1.2方法，得到魚腥草粗多糖，按照實驗部分1.4方法測定多糖，結果見表3。

表2 魚腥草多糖正交L9（34）因素及水平設計表Tab.2Polysaccharides of L9（3）4orthogonal design table of factors and levels

表3 魚腥草多糖正交L9（34）實驗結果及分析Tab.3Polysaccharides of L9（3）4orthogonal experiment results and analysis

正交試驗結果（表3）表明，影響微波法提取魚腥草多糖的主要因素依次為：提取時間（C）≈料液比（A）＞提取溫度（B）＞提取次數（D），最佳組合為：A2B3C3D1，即最佳條件：料液比（m/V）為 1∶20、提取溫度為80℃、提取時間為40min、提取次數為2次，優化后在此條件下重復試驗，魚腥草多糖提取率可達5.35%。

4 結論

本實驗采用超聲提取技術，超聲作用可以破碎細胞，改變植物的組織，加速溶解有效成分，催進擴散和傳質超聲提取適用于多種天然植物的有效成分的提取，如生物堿，萜類化合物，黃酮化合物，脂質核揮發油等。超聲提取伴隨強度很大的聲波的傳播會出現聲沖流，聲空化，聲輻射力以及聲致發光等許多非線性過程，具有空化效應、機械效應、熱效應、和化學效應等特點。保持有效成分活性的同時也減少了色素和蛋白質等雜質的析出，簡化了提取純化的流程，是一種良好的提取多糖的方法。

本研究采通過單因素實驗選擇對魚腥草中多糖進行微波提取，以魚腥草中的多糖提取率為指標，分別考察了對料液比、提取溫度、提取時間和提取次數等因素對提取率的影響，通過正交設計法對微波法提取魚腥草多糖的最佳條件進行了優化：料液比（m/V）為1∶20、提取溫度為80℃、提取時間為40min、提取次數為2次。本研究優化的實驗條件，對于今后開發利用魚腥草多糖有重要的意義。

［1］齊迎春,胡誠.藥食兼用魚腥草［J］.中國林副特產,1997，（4）:43-65.

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［3］張儉,伍賢進,盧紅梅,等.魚腥草制劑抗炎動物模型的建立及研究［J］.時珍國醫國藥,2007,18（6）:1290-1291.

［4］齊迎春,胡誠,田園政,等.魚腥草莖葉營養成分對比分析［J］.特產研究,2001,（4）:45-46.

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［6］李合生,孫群,趙世杰,等.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京:高等教育出版社,2007.

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