馬鈴薯紡錘塊莖類病毒山西分離物侵染性克隆的構建

白云鳳，閆建俊，張耀，張忠梁，馮瑞云，張維鋒

（山西省農業科學院作物科學研究所，農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西 太原 030032）

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）是發現最早的一種類病毒，也是已知最小的可以在寄主體內自我復制的病原。其分子是單鏈環狀裸露的RNA，沒有外殼蛋白質包裹，因此，沒有免疫原性。PSTVd是引起馬鈴薯品種退化的重要病害之一[1-2]，它能在細胞核內復制和累積，莖尖脫毒都難以剔除。其傳播途徑廣泛，包括汁液傳播（切刀、種薯切塊間摩擦、農機具以及莖、葉接觸等擴散）、媒介昆蟲傳毒、實生種子帶毒等。根據受侵染植株出現的癥狀，PSTVd可分為強系、弱系和中間株系。強系通常能使植株減產60%以上。PSTVd侵染后潛伏期長并能持續感染，使馬鈴薯產量和品質嚴重下降，而迄今尚無有效方法防治。

本研究通過構建PSTVd的cDNA侵染性克隆，使人們在DNA水平上能開展該病毒的分子生物學研究，亦為采取有效措施進行防治提供依據，為類病毒的毒源保存提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

感病薯塊采自山西省陽曲縣，品種為紫花白。番茄品種為矮紅寶，由山西省農科院作物科學研究所轉基因實驗室保存?？寺≥d體pBS-T購自Takara生物公司，大腸桿菌Top10由山西省農科院作物科學研究所轉基因實驗室保存。生化和分子生物學試劑包括 RNA酶抑制劑（Rnasin），M-MLV 反轉錄酶，Taq DNA 聚合酶，dNTP，T7 RNA聚合酶等，均購自Takara生物公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自博邁德生物公司。

1.2 PSTVd的cDNA合成和PCR擴增

1.2.1 引物設計 根據報道的PSTVd同源序列設計合成1對引物，正向引物：5′-ATCCCC GGGGAAACCTGGAGCGAAC-3′；反向引物：5′-CCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 馬鈴薯總RNA提取 其采用文獻[3]的改進方法。

1.2.3 RT-PCR擴增 以馬鈴薯感病薯塊總RNA為模板，按以下步驟反轉錄合成cDNA第1 鏈：2 μg 總 RNA，10μmol/L 反向引物 2 μL，10mmol/L 的 dNTP 1.5 μL 和 ddH2O 12.5 μL，混勻，70℃水浴5 min，冰浴5 min，再加入5×RT buffer 5 μL，RNasin 1 μL 和 M-MLV 反轉錄酶1 μL，混勻后，放于 42 ℃ 60min，然后于 70℃15 min停止反應。以cDNA第1鏈為模板進行PCR 擴增。擴增體系總體積為 50μL，包括：5 μL cDNA 第 1 鏈，10×PCR buffer 5 μL，10mmol/L dNTPs 1 μL，10μmol/L正向引物 2 μL，10μmol/L反向引物 2 μL，Taq DNA 聚合酶（大連，TaKaRa）0.3 μL和 ddH2O34.7 μL。反應程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環；72℃延伸10min。

擴增的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收后，連接到pBS-T載體上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，酶切初步鑒定后，挑選陽性克隆，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 侵染性cDNA克隆的體外轉錄和接種

將陽性克隆用BamHI線性化后作為模板，利用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄。轉錄產物用于接種。寄主植物番茄苗種于花盆。出苗2周后，提取葉片總RNA，并以此為模板進行RT-PCR檢測，反應體系同1.2.3，確認無毒后進行接種。接種物分別是PSTVd轉錄產物、BamHI線性化的陽性克隆和pBS-T空質粒。接種前，將待接種葉片表面均勻涂抹金剛砂，之后用戴PE手套的手指蘸取接種液逆葉毛方向輕輕摩擦葉片，每株植物接種2～3個葉片。接種后10min向葉片表面噴灑清水，沖洗殘留的金剛砂。接種后的植物保濕1 d，然后正常培養，約2周后取葉片提取總RNA，進行RT-PCR檢測，同時將RT-PCR產物純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 PSTVd山西分離物的cDNA合成和PCR擴增

以馬鈴薯感病塊莖的總RNA為模板進行RT-PCR擴增。1.0%瓊脂糖凝膠分離，顯示擴增產物片段大小約360bp（圖1），與預期相符?；厥諗U增產物，與克隆載體pBS-T連接，陽性克隆測序。結果表明，該片段長度為359 bp，含71個A，79個 T，108個C，101個 G，G＋C含量58.2%。將克隆的PSTVd命名為PSTVd山西分離物（PST Vd-SX），將克隆載體命名為pBS-PSTVd-SX。

2.2 PSTVd-SX核苷酸序列分析

用軟件DNAMAN對PSTVd-SX的核苷酸序列進行二級結構分析，表明PSTVd-SX的RNA分子能通過分子內序列互補形成致密的二級結構（圖2-A）。將克隆序列作為query進行Blast搜索，結果表明，該序列與PSTVd荷蘭分離物（GenBank登陸號：AY372400.1）的序列完全一致。將其與PSTVd東北分離物[4]、河北分離物[5]及已公布的PSTVd弱株系（GenBank登陸號：M14814.1）、強株系（GenBank 登陸號：U23058.1）和中間株系（GenBank登陸號：AY937179.1）進行序列比對（圖2-B），共有12個核苷酸具有多態性，其中有2個發生在左末端，6個發生在致病區，3個發生在中央保守區，1個發生在可變區。

2.3 PSTVd-SX的體外轉錄物及其cDNA的侵染性

將質粒pBS-PSTVd-SX用DNA限制性內切酶BamHI消化使之線性化之后，用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄。之后分別用轉錄產物、線性化的pBS-PSTVd-SX和pBS-T空質粒給番茄植株接種。接種20d后，接種轉錄產物和pBS-PSTVd-SX質粒的植株葉片出現輕微黃斑，心葉稍皺，接種pBS-T空質粒的植株正常（圖3-A）。提取接種株上部葉片總RNA進行RT-PCR檢測，接種PSTVd的體外轉錄物及其pBS-PSTVd-SX質粒的植株均顯示特異條帶，而接種pBS-T空質粒的植株無特異條帶（圖3-B）。將接種轉錄產物和質粒pBS-PSTVd-SX植株的RT-PCR產物純化后測序，結果表明，二者均與PSTVd-SX的序列完全一致。

3 討論

PSTVd是第1個被鑒定的類病毒，在體外最小自由能的情況下呈棒狀或半棒狀的二級結構[6]，含有5個結構功能區：左末端區、致病區、中央保守區、可變區和右末端區[7]。致病區與病毒的致病性有關，中央保守區與病毒的復制有關。PSTVd山西分離物與其他幾個國內外代表性株系的核苷酸序列比對結果表明，其與荷蘭的弱株系一致性最高，僅有2個核苷酸的差異，結合該分離物對番茄的致病性，初步將其歸為弱株系。在本研究范圍內，PSTVd共有12個核苷酸具有多態性，其中有6個發生在致病區。分析這6個位點的核苷酸變化趨勢，與株系強弱沒有直接關系，似乎預示著致病性主要與二級結構相關。

PSTVd容易發生變異。幾個核苷酸的變換不僅影響致病性，而且影響到它的寄主范圍[8]。本研究構建的PSTVd侵染性克隆在接種番茄后并未發生變異。保存質?；蚓罕缺４嫒~片更為簡單經濟。PSTVd侵染性克隆的構建為毒源保存提供了一條新的途徑，也為下一步的遺傳操作奠定了基礎。

交互保護是植物與病原物互作中常見的現象[9-10]。當植株被類病毒弱株系侵染之后，會對相近病毒包括PSTVd的強株系的侵染產生抗性[11]。PSTVd傳播途徑廣，莖尖脫毒難以剔除，實生種子也能傳播，生產上很難防治。能否通過定點突變構建弱毒甚至無毒的PSTVd株系用于植物交叉保護，使馬鈴薯免受強株系的侵染，降低產量損失，尚需研究探討。

本研究構建的PSTVd侵染性克隆在PSTVd序列的上、下游均有冗余序列，仍能在植物體內啟動轉錄。如果在其末端連接功能基因也能啟動轉錄，將對研究基因功能或作為生物反應器具有重要意義。因為PSTVd分子量小，其基因組僅具最小RNA病毒的1/10，容易構建不同毒性的株系，并且接種簡單，比植物病毒載體更易進行遺傳操作。

［1］Gora A，Candresse T，Zagorski W.Analysis of the population structure of three phenotypically different PSTVd isolates[J].Archives Virology，1994，138：233-245.

［2］白云鳳.馬鈴薯束頂型退化及其防治 [J].山西農業科學，1987（5）：23-25.

［3］白云鳳，郭志華，白冬梅，等.馬鈴薯總RNA提取和鑒定方法的改進[J].園藝學報，2007，34（4）：1059-1062.

［4］呂典秋，李學湛，楊希才，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）東北分離物的核苷酸序列分析[J].農業生物技術學報，2005，13（1）：131-132.

［5］吳志明，賈曉梅，謝曉亮，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒RTPCR檢測及全序列分析 [J].華北農學報，2003，18（院慶專輯）：63-65.

［6］Dingley A J，Steger G，Esters B，et al.Structural characterization of the 69 nucleotide Structural characterization of the 69 nucleotide potato spindle tuber left-terminal domain by NMR and thermodynamic analysis[J].J Mol Biol，2004，334（4）：751-767.

［7］Keese P，Symons R H.Domains in viroids:Evidengce of intermolecular RNA rearrangenments and their contribution to viroid evolution[J].Proc Natl Acad Sci，1985，82：4582-4586.

［8］Wassenegger M，Spieker R，Thalmeir S，et al.A Single nucleotide substitution converts potato spindle tuber viroid（PSTVd）from a noninfectious to an infectious RNA for Nicotiana tabacum[J].Virology，1996，226：191-197.

［9］丁金城，喻衣蓉.黃瓜枯萎病生物防治的研究[J].天津農業科學，1985（1）：14-18.

［10］Khoury J，Singh R P，Boucher A，et al.Concentration and distribution of mild and severe strains of Potato spindle tuber viroid in cross-protected tomato plants[J].Phytopathology，1988，78：1331-1336.

［11］Qi Y，Ding B.Inhibition of cell growth and shoot development bya specific nucleotide sequence in a noncoding viroid RNA[J].The Plant Cell，2003，15：1360-1374.