星點設計–效應面法優化葡萄枝蔓中白藜蘆醇的提取工藝

楊星星，謝紅旗，李清明，曾建國,2,3*，熊興耀,2*

（1.湖南農業大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.作物種質創新與資源利用國家重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南省中藥提取工程研究中心，湖南 長沙 410331）

葡萄（Vitis viniferaL.）的根、莖、葉、果實均可入藥，具有補氣血、利小便、解毒、消腫等功效[1]。Sierra等[2]發現葡萄枝條中含有反式白藜蘆醇（trans–resveratrol）和葡萄素。楊敬芝等[3]從刺葡萄地上部分分離得到白藜蘆醇等7個芪化物。白藜蘆醇（3,4’,5–三羥基二苯乙烯）是含有芪類結構的非黃酮多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、預防心血管疾病等作用[4]。目前國內多采取正交設計或均勻設計法優化植物中有效成分的提取工藝。這兩種方法均采用線性數學模型，精度不高。星點設計（central composite design，CCD）是在析因設計的基礎上，采用非線性數學模型擬合，復相關系數較高，于中心點進行的重復性試驗可提高試驗精度，預測值更接近于真實值，并且具有試驗次數較少、可采用直觀三維效應面進行數據處理與擬合等優點，已在藥物提取和處方工藝的優化中應用[5–10]。本試驗中以葡萄栽種過程中廢棄的葡萄枝蔓為原料，以白藜蘆醇得率為指標，運用星點設計–效應面法優化白藜蘆醇的提取工藝條件，旨在為白藜蘆醇的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

葡萄枝蔓樣品由湖南省中藥提取工程研究中心提供。白藜蘆醇對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號為111535–200502，純度≥98%）。

1.2 主要試劑及儀器設備

甲醇、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純，所有試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器：Waters 1525 型高效液相色譜儀，Waters 2998工作站（美國沃特世公司）；Mettler ML204電子天平（梅特勒–托利多儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制造機械有限公司）；KQ–5200DB臺式數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 樣品溶液中白藜蘆醇得率的確定

1.3.1 對照品溶液和樣品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取白藜蘆醇對照品10.5 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解，稀釋到刻度，搖勻。

樣品溶液的制備：將葡萄枝蔓粉碎后，過孔徑（850±29） μm篩，精密稱取葡萄枝蔓粉碎樣5.0 g，用乙醇回流提取法提取，將提取液冷卻至室溫后5 000 r/min離心15 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜抽濾，得供試品溶液。

1.3.2 標準曲線的制作

分別精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按色譜條件進樣檢測。色譜條件為：色譜柱為Hypersil，BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇和1%乙酸水，梯度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；檢測波長310 nm。以對照品質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），以白藜蘆醇色譜峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。

1.3.3 精密度試驗、穩定性試驗和重復性試驗

精密度試驗：取同一對照品溶液，重復進樣6次，按1.3.2中色譜條件進行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據峰面積計算相對標準偏差。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，在溶液配制后0、2、4、8、12、24 h各進樣5 μL，按1.3.2中色譜條件進行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據峰面積計算相對標準偏差。

重復性試驗：取同一批供試品6份，按1.3.2中色譜條件進行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據峰面積計算相對標準偏差。

1.3.4 加樣回收率測定

精密稱取6份葡萄枝蔓粉碎樣，每份3.0 g，分別加入白藜蘆醇對照品5.0 mg，按樣品溶液制備方法制備，按 1.3.2中色譜條件進行測定。計算白藜蘆醇的回收率及回收率相對標準偏差。

1.3.5 白藜蘆醇含量的測定

精密吸取抽濾后的提取液5 μL，按1.3.2中色譜條件進行測定，每個樣品進樣3次，得樣品中白藜蘆醇含量。

根據樣品溶液中白藜蘆醇含量計算白藜蘆醇得率。白藜蘆醇得率=提取液白藜蘆醇質量濃度（mg/mL）×提取液體積（mL）/樣品質量（g）。

1.4 提取工藝的優化

采用星點設計–效應面法優化葡萄枝蔓中白藜蘆醇的提取工藝。提取因素為乙醇體積分數、提取時間和溶媒比、提取次數。因提取次數為非連續變量，不能進行回歸處理，結合預試驗結果和工業生產實際，暫固定為2次。預試驗中乙醇體積分數（x1）、提取時間（x2）和溶媒比（x3）的值分別為65%～95%、50～150 min、5～15。按試驗設計的統計學要求[5]確定星點設計的因素與水平（表1）。

表1 星點設計的因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

以白藜蘆醇得率（y）對乙醇體積分數（x1）、提取時間（x2）和溶媒比（x3）進行線性回歸和二次方程擬合。對擬合出的較適合的模型進行方差分析[5]。依據模型方程繪制響應面立體分析圖及等高線。因變量曲面圖是三維圖，只能表達含兩個自變量的函數，所以，將3個自變量中的一個固定為中值，分別以擬合的目標函數為數學模型，繪制因變量曲面圖，利用該圖對影響白藜蘆醇得率的任意2種條件的交互作用進行分析和評價。通過等高線的形狀判斷交互作用的強弱：橢圓形表示兩因素交互作用顯著；圓形表示兩因素交互作用不強[10]。

圖1 對照品與樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standard and the sample

1.5 優化結果驗證

精確稱取5.0 g葡萄枝蔓粉碎樣3份，按照試驗所得優化提取條件進行提取。將提取液離心15 min后過0.45 μm微孔濾膜，測定白藜蘆醇含量，進而計算出白藜蘆醇得率。將結果與擬合方程預測值進行比較，計算實測值與預測值的偏差。

1.6 數據分析

用Design–Expert 8進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇含量檢測方法的評價

以甲醇和1%乙酸水為流動相，高效液相色譜圖基線穩定，樣品中組分分離度好，在此色譜條件下，葡萄枝蔓提取液中白藜蘆醇保留效果較好，基本達到基線分離（圖1）。

白藜蘆醇質量濃度的標準曲線方程為y= 43 217x– 527，r=0.999 5。結果表明：白藜蘆醇質量濃度與峰面積線性關系良好。

精密度試驗結果：白藜蘆醇峰面積的相對標準差為0.4%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗結果：白藜蘆醇峰面積的相對標準差為0.9%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗結果：白藜蘆醇峰面積的相對標準差為0.7%，表明該方法的重復性良好。

白藜蘆醇回收率為100.31%，相對標準差為1.7%。

2.2 提取工藝的優化結果

2.2.1 星點設計試驗結果

星點設計的試驗結果見表2。

表2 星點設計試驗結果Table 2 Results of central composite design

2.2.2 模型方程

所得白藜蘆醇得率的線性回歸方程為：y=0.377 31+0.015 26x1–0.000 517x2+0.002 959x3（r= 0.549 7，P＜0.01）。

盡管模型通過檢驗，但擬合度不佳，預測性較差，因此線性模型不合適。

表3中二次方程的顯著性檢驗結果表明：一次項乙醇體積分數對白藜蘆醇得率線性效應的影響顯著，料液比對白藜蘆醇得率線性效應的影響不顯著；二次項中除料液比外的其他兩因素對白藜蘆醇得率曲面效應的影響均顯著；乙醇體積分數與提取時間的交互作用極顯著。綜上可知，二次方程的r值高于線性方程的，P＜0.01，表明二次方程具有高度顯著性，說明模型與試驗實際擬合良好，試驗誤差小，應用效應面法優化葡萄枝蔓中白藜蘆醇的提取工藝是可行的。

表3 擬合二次方程的方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of quadratic model

2.2.3 提取條件優化結果

由圖2～4可以看出，乙醇體積分數與提取時間、溶媒比的交互作用均顯著；溶媒比與提取時間的交互作用不顯著。從圖2～4中等高線圖可以看出各因素的極值應在圓心處，初步估計乙醇體積分數、提取時間、溶媒比極值的取值范圍為80%～95%、115～135 min、8～11。通過Design–Expert 8 軟件分析，得出回歸模型的最大值點，即乙醇體積分數90.2%，提取時間129.5 min，溶媒比8.8，在此條件下，白藜蘆醇得率為1.75 mg/g，因此，將乙醇體積分數90.2%、提取時間129.5 min、溶媒比為8.8，回流提取2次確定為較優提取工藝。

圖2 不同乙醇體積分數與提取時間條件下的白藜蘆醇得率Fig.2 Resveratrol yield rate under different ethanol concentrations and extraction time

圖3 不同乙醇體積分數與溶媒比條件下的白藜蘆醇得率Fig.3 Resveratrol yield rate under different ethanol concentrations and solvent ratios

圖4 不同溶媒比與提取時間條件下的白藜蘆醇得率Fig.4 Resveratrol yield rate under different solvent ratios and extraction time

2.3 優化結果的驗證

驗證試驗的結果表明：白藜蘆醇的平均得率為1.73 mg/g。驗證結果與擬合方程預測值的偏差為1.14%。偏差較小，可見，由數學模型所得到的較優條件與設計目標相符，試驗設計和數學模型具有可靠性和重現性。

3 結論與討論

本研究結果表明，用乙醇回流提取法從葡萄枝蔓中提取白藜蘆醇，乙醇體積分數、提取時間對白藜蘆醇得率的影響顯著。通過回歸分析和驗證試驗，得到較優提取條件為乙醇體積分數90.2%，提取時間129.5 min，溶媒比為8.8，回流提取2次。在此條件下，葡萄枝蔓中白藜蘆醇的得率為1.73 mg/g。該得率不僅比預試驗中最佳得率1.69 mg/g的提取效果高出2.37%，且提取成本降低。經方差分析，以提取乙醇體積分數（x1）、回流時間（x2）和溶媒比（x3）為自變量，以白藜蘆醇得率（y）為因變量擬合的二次方程模型有效，對試驗結果擬合較好，有一定應用價值。

在本試驗的基礎上還可考察不同提取方法對白藜蘆醇得率的影響，以優化提取效果。

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