血清中17α-羥孕酮的測定方法及其研究進展*

周劍 ，戴新華 ，李紅梅 ，弓愛君

(1.北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083； 2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013)

血清中17α-羥孕酮的測定方法及其研究進展*

周劍1，2，戴新華2，李紅梅2，弓愛君1

(1.北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083； 2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013)

闡述了17α-羥孕酮的檢測在臨床診斷研究方面的重要意義，綜述了血清中17α-羥孕酮的檢測方法及其研究進展。

血清17α-羥孕酮；免疫法；高效液相色譜法；同位素稀釋質譜法

17α-羥孕酮（C21H30O3）是在合成糖皮質激素和性類固醇過程中產生的一種C-21內源性孕激素，可以在17α-羥化酶作用下由孕酮轉化，或者在3β-羥類固醇脫氫酶（3β-HSD）作用下由17α-羥孕烯醇酮轉化，主要產生于腎上腺皮質，部分產生于性腺。血清中的17α-羥孕酮主要與性激素共同作用，促進個體器官的發育。育齡女性正常值為：卵泡期0.1～0.8 ng／mL，黃體期 0.27～2.9 ng／mL，妊娠末3個月2～12 ng／mL ；男性正常值為 0.31～2.13 ng／mL［1，2］。

血清中17α-OHP的測量是診斷因21-羥化酶缺乏所引起的先天性腎上腺皮質增生癥（CAH）的主要手段［3-5］。先天性腎上腺皮質增生癥（CAH）代表常染色體隱性激素的紊亂，這種紊亂主要是由于人體內不同酶的缺乏導致，這些酶的缺乏影響人體內合成氫化可的松和甾體激素，增加了17α-羥孕酮和雄激素的分泌，而先天性腎上腺增生90%以上是因為21-羥化酶的缺失［6］。21-羥化酶缺乏的先天性腎上腺皮質增生患者血清中17α-羥孕酮濃度明顯升高，11-羥化酶缺乏時，17α-羥孕酮上升幅度較?。?，8］。約 6% 的成年多毛女性有不同程度的21-羥化酶缺乏，這一類遲發型缺乏癥病例中17α-羥孕酮濃度常超過卵泡期的高限0.9 ng／mL。17α-羥孕酮的測定也用于分析男性和女性的普通痤瘡、男性禿頂及一些不明原因的不育癥［9］。

1 血清中17α-羥孕酮的測定方法

關于血清中17α-羥孕酮的研究開始于20世紀50年代，開始只是關注其在人體內的反應和作用，對于血清中17α-羥孕酮檢測的廣泛研究始于20世紀六七十年代，開始時采用免疫的方法主要為超微分析系統（ultra micro analytic system）和超微的酶聯免疫法(ELISA)，在此基礎上又發展了放射免疫法（radioimmunoassay）和時間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay），后來又開發了液相方法、氣相色譜質譜法和液相色譜-質譜法等。

1.1 放射免疫法(RIA)

大部分的分析方法都需要用有機溶劑萃取或者用柱色譜分離，然后用RIA分析，需要采用氘標記的17α-羥孕酮或其它標記激素作為示蹤標記物。Jndsay. F. Hotman等開發了一個直接固相放射免疫法，不使用萃取和離心的步驟，只需添加兩種有機溶劑，該方法能在24 h內分析1 200個樣品。新西蘭臨床生物化學中心的K. H. James Yeo等在1984年就發表了關于血清中17α-羥孕酮檢測的放射免疫方法，他們主要采用甲苯和正己烷的混合溶液進行簡單萃取，然后以125I作為示蹤物，以兔血清為抗體直接進行RIA分析，日間和日內標準偏差分別小于15%和小于10%，靈敏度能達到3 pg，分析回收率達到93.5%（RSD=1.6%，n=15）。分析用時約3 h，比以3H為示蹤物更加快速，而且實驗成本大為降低［10］。大部分主要的甾類激素都能夠在唾液中呈現，研究表明其濃度與人體血清中的濃度存在一定的聯系，所以有時在血清樣品中難以取得時，唾液中激素的檢測也能起到積極的作用，但由于唾液中激素含量相對較低，這就要求特異性好和靈敏度更高的放射免疫分析法，比利時的J. Bourque等研究了人體唾液中孕激素（主要是孕酮）的檢測方法，他們將融化的唾液樣品與標準品、標記激素和稀釋的抗體血清混合，渦旋，37℃培育30 min，然后4℃過夜，在冰浴中將激素按是否結合標記分離，進行RIA測定，該方法的日間和日內不確定度均小于10%，回收率為90%～100%［11］。為了檢測更低濃度唾液和血清中的17α-羥孕酮，希臘佩特雷醫學院內分泌科的Panagiotis. G. Mylonas等采用與J. Bourque等相同的抗體和孵化方法，增加了10倍樣品量和孵化時間以提高靈敏度，實驗測定了64個健康志愿者的唾液和血清樣品，分成4個組別分離處理后直接進行RIA測定，唾液中和血清中17α-OHP含量的關聯性r2在0.62～0.77之間，實驗證明該方法能很好地檢測唾液和血清中的低濃度17α-羥孕酮［12］。

1.2 酶聯免疫法

在免疫分析法被大量應用于激素分析的情況下，放射免疫法的諸多缺點如示蹤物儲藏時間短、廢物核輻射泄露、必須特殊的放射性裝置等也漸漸受到分析人員的詬病，在此基礎上引入了酶聯免疫法等非放射性免疫分析法。Walter Hubl等于1988年用辣根過氧化物酶作為酶標記，開發了一個雙抗體／聚乙烯乙二醇固相酶聯免疫的方法，該方法使用涂有蛋白A和第二抗體的微量滴定管，大大節約成本，且方法有較好的重復性（相對標準偏差為5.0%～6.0%）和回收率（91%～97%）［13］。古巴免疫分析中心的 Ernesto Carlos Gonzále等人于2008年開發了一種快速、簡單的酶聯免疫方法，以17α-羥孕酮結合堿性磷酸酶與17α-羥孕酮結合血清競爭，采取兔抗體血清，分析濾紙上血點內17α-羥孕酮，分析緩沖液中以達納錯替代17α-羥孕酮甾體激素結合蛋白，整個分析時間為3 h，分析范圍是10～250 nmol／L，日間和日內標準偏差與17α-羥孕酮濃度有關分別為5.5%～8.2%和6.4%～9.1%，分析回收率達到98%～103%，該方法能夠很好地用于新生兒CAH檢測［14］。

1.3 時間分辨熒光免疫法

芬蘭臨床分析中心Ruben Rene Gonzalez等在RIA方法的基礎上開發了一種快速、高通量的直接固相時間分辨熒光免疫法（TRFLA）檢測血清和干血濾紙斑點中的17α-羥孕酮，他們使用17α-OHP-3-carboxymethyloxime與聚賴氨酸（polylysine）結合作為標記，使得每個17α-羥孕酮分子能夠結合34原子的銪，具有更高的放射性活度，這個分析基于標記的17α-OHP3CMO和17α-羥孕酮在血液樣本中與多克隆兔17α-羥孕酮抗體的競爭，標記的抗體混合物通過與兔抗體表面結合進行分離，分析緩沖液包含達那唑來取代17α-羥孕酮與血清中蛋白的綁定。對于血清樣品，常溫下孵化完成需要1 h，而對于干血濾紙斑點需要在4℃放置過夜，同一分析物采取的兩種樣本測定結果有較好的一致性，該方法對血清和干血濾紙斑點中17α-羥孕酮最低檢測限分別為0.10 nmol／L和0.75 nmol／L，日內和日間測定結果的相對標準偏差在 5%～15% 之間［15］。

1.4 液相色譜法

大多數免疫方法在進行血清中的激素分析前，首先要對樣品進行層析分離或者用其它方法純化，造成整個分析過程冗長、復雜，而且在前處理過程中容易造成待分析成分的丟失，由于交叉反應難以保證分析的特異性，使得分析結果不準確，分析不確定度增加。為了避免上述缺點，液相色譜被引用進行唾液或血清中的激素分析?？的腋翊髮W的Ernesto Canalls等較早開發了血清中17α-羥孕酮的高效液相色譜分析方法，該實驗用二氯甲烷從1 mL血清中萃取待測物，萃取液用0.1 mol／L的氫氧化鈉溶液和水沖洗后在氮氣上吹干，然后用甲醇-水混合液復溶，樣品用μBondapak C18色譜柱分析，17α-羥孕酮檢出限達到 2.5 μg／L，加標回收率達到95%～105%，分析結果的不確定度小于10%。該方法通過優化液相流動相，使得血清中氫化可的松、11-羥基可的松和17α-羥孕酮的保留時間不同，從而同時檢測血清中多種激素含量，方法簡單、準確且與RIA方法測定數據趨勢一致［16］。

1.5 氣相色譜-質譜法

隨著質譜技術的發展，由于其較高的靈敏度而被大量引入進行血清中激素的分析研究，上海復旦大學的鄧春輝、張祥民等人使用N，O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺作為衍生試劑，以乙腈為溶劑，在微波照射下使得血清中17α-羥孕酮發生三甲基硅烷化反應，微波功率700 W，實驗發現微波照射可以增加羰基結合含氧基團，降低衍生反應時間，反應時間縮短為120 s，遠小于傳統的反應時間45 min。衍生物進氣相色譜-質譜（GC-MS）檢測，選用HP-5 MS柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），采用不分流模式，進樣體積為1 μL，柱溫程序：初始溫度80℃，以15℃／min的速度升溫到300℃，保持10 min，采用選擇離子檢測模式（SIM）在EI源下檢測m／z359離子，四級桿、傳輸線和離子源溫度分別為150，280，230℃。該方法定性檢出限達到 1.0 ng／mL，方法重復性相對不確定度小于7.9%，方法回收率為102%［17］。

1.6 液相色譜-質譜法

文獻記載了很多氣相色譜-質譜聯用方法測定血清中17α-羥孕酮等甾體激素，這些方法都有很好的特異性，但是往往反應通量很低，需要較大體積的血清原料，美國鹽湖城大學Mark. M. Kushnir等開發了一種靈敏、特異的液相色譜串聯質譜法（LC-MS／MS）同時分析4種血清中腎上腺甾體激素，該方法前處理使用樣品量為200 μL，加入一定量的內標標準溶液，樣品通過固相微萃?。⊿PE），最后用甲基叔丁基醚（MTBE）洗脫，洗脫液在氮氣下吹干后，加入300 μL pH 10的羥胺水溶液復溶衍生，渦旋而且在90℃孵化30 min，衍生后溶液用2 mL MTBE萃取，萃取溶液吹干后用流動相復溶進行質譜檢測。質譜條件：ESI源，多重離子檢測模式（MRM），檢測離子對為361.2／124.1，361.2／112.1，該方法定量檢出限為0.05 μg／L，定性檢出限為0.025 μg／L，回收率達到 97.2%［18］。

上述方法雖然采用了LC-MS-MS提高了靈敏度和特異性，但是實驗中采用了衍生的步驟，而衍生實驗對于實驗人員的專業要求較高，不利于各個實驗室的普及，在此基礎上加拿大的Michele. L. Etter等開發了SPE萃取后直接進行LC-MS-MS測定的方法，氘代17α-OHP 作為內標加入血清樣品中，混合均勻后進行SPE萃取，用C16反相氨基色譜柱分離，分析時間為7 min，定量用ESI源正離子模式選擇離子監控模式，17α-羥孕酮和氘代17α-羥孕酮離子對分別為：331／109和339／113。該方法日內和日間不確定度分別為7.4%和10.0%，線性范圍為0.156～80 nmol／L，定量檢出限為 0.2 nmol／L［19］。

2 國內外血清中17α-OHP臨床參考系統研究現狀及展望

目前，涉及臨床、大眾健康、生物技術等領域的標準物質研制是各國研究的重點和熱點［20］。歐盟（IRMM）僅肌酐有不同濃度的基體標準物質，如血清肌酐BCR573，BCR574以及BCR575；血清中雌二醇也有3種不同濃度的基體標準物質BCR576，BCR577及BCR578；血清氫化可的松標準物質ERM-DA192，ERM-DA193，ERM-DA451三種；血清中孕酮的標準物質BCR-348R，ERM-DA347等。美國NIST已經研制了多種血清基體標準物質和激素類純品標準物質，例如膽固醇純品標準物質SRM911，SRM911a；尿素純品標準物質SRM912a；尿酸純品標準物質SRM913a；肌酐純品標準物質SRM914a；氫化可的松純品標準物質SRM921；冰凍血清標準物質（肌酸）967a；冰凍血清標準物質（氫化可的松、睪酮、孕酮）SRM971等。作為其工作的一部分，開發了新的快速液相-同位素稀釋質譜法（ID-LC／MS）來代替之前的氣相-同位素稀釋質譜法（ID-GC／MS）。

澳大利亞針對奧運食品中興奮劑檢測也研制了睪酮及其氘代物的純度標準物質，分別為NARL CRM M914和NARL CRM D546，已應用于臨床檢驗的量值溯源。日本臨床化學方面標準物質主要有膽固醇純品標準物質NMIJ CRM 6001-a、肌酐純品標準物質NMIJ CRM 6005-a。

國際臨床檢驗高準確度標準物質也有很多不完善之處，有很多檢驗項目，包括激素、傳染病血清學檢測標志物等缺乏相應的標準物質，只有一些標準方法而沒有相應的標準物質配合使用，如17α-羥孕酮、雌酮以及雌三醇等均無有證標準物質以供臨床檢驗使用。

目前，中國計量科學研究院化學所最新研制的標準物質有冰凍人血清尿素成分標準物質（GBW 09157）、冰凍腎病人血清尿酸成分分析標準物質（GBW 09169）、冰凍人血清肌酐成分分析標準物質（GBW 09170，GBW 09171），及冰凍人血清葡萄糖、肌酐、尿酸、尿酸標準物質（GBW 09174，GBW 09175，GBW 09176）。然而國內針對純品標準物質17α-羥孕酮、血清中的重要非肽激素類物質如17α-羥孕酮的標準物質研究尚未見報道。中國計量科學研究院化學所應國家科技部門的要求，正在進行利用LC-IDMS方法針對純品17α-羥孕酮和血清中17α-羥孕酮基準方法的研究，一些方法學檢驗數據表明，該方法準確可靠。目前正在對該方法進行完善，以提高靈敏度、增加檢測通量、減少溶劑用量。

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Determination Method of 17α-OHP in Serum and Its Research Progress

Zhoujian1，2， Dai Xinhua2， Li Hongmei2， Gong Aijun1
(1. School of Chemical and Biological Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China；2. Chemical Metrology and Analytical Science Division， National Institute of Metrology， Beijing 100013， China)

The important of measure of 17α-OHP in the field of clinical diagnosis was illustrated.Determination methods for 17α-OHP and their research progress were systematically summarized.

erum 17α-OHP; immunization; HPLC; isotopic dilution MS

O652.2

A

1008–6145(2012)02–0096–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2012.02.30

*國家科技基礎專項(2011FY130100)

聯系人： 周劍；E-mail： zhoujian_8382@yahoo.cn

2011-11-03