柴 川 白永濤 文紅梅 宋利華 涂佳玉 單晨嘯
1.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京 210029;2.河南省新鄉醫學院第一附屬醫院,河南 新鄉 453100
淡豆豉是由豆科植物大豆 [Glycine max(L.)Merr.]的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經發酵加工而成的制品,歷版《中國藥典》均有記載,為常用中藥,具有解表,除煩,宣發郁熱等功效,可用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥[1]。淡豆豉處方大豆用量最高,大豆異黃酮類為其主要活性成分,具有明顯改善心血管功能[2],降低去卵巢大鼠膽固醇水平和調節血脂的功效[3-4],緩解由于更年期雌激素不足所引起的骨質疏松[5-6]。淡豆豉中異黃酮分為游離型苷元和結合型糖苷兩類,其中苷元比糖苷具有更強的生物活性和更高的生物利用度。淡豆豉中異黃酮測定方法以高效液相色譜 (HPLC)法最多[7-9]。本文建立了快速測定淡豆豉中大豆苷元 (Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)、染料木素 (Genistein)3種主要異黃酮苷元成分的超高效液相色譜法 (UPLC法),與HPLC法相比,分析時間短,分析效率高,重現性好等特點,可以更好地用于淡豆豉藥材的質量評價。
儀器 Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀:包括在線真空脫氣系統,四元超高壓泵系統,自動進樣器,柱溫箱,二極管陣列檢測器,Empower 2工作站。KQ-500DE型醫用數控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);Startorius BP211D電子天平 (德國Startorius公司)。
對照品 大豆苷元、黃豆黃素、染料木素均購于南京澤朗醫藥科技有限公司 (經UPLC分析純度均在98%以上)。乙腈為色譜純,水為超純水,其它試劑為分析純。
淡豆豉購于南京市藥材公司,經南京中醫藥大學藥學院王春根教授鑒定為由豆科植物大豆 [Glycine max(L.)Merr.]的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經發酵加工而成的淡豆豉制品,批號:090810、090927、091025,產地為河南。
2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity BEH C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm,1.7μm);流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(24:76);檢測波長:260nm;進樣量:1μL;柱溫:40℃;流速:0.4mL·min-1;樣品室溫度:4℃?;旌蠈φ掌泛偷刽鶚悠返纳V圖見圖1,淡豆豉樣品中3種異黃酮苷元成分均達到基線分離。
圖1 大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對照品色譜圖 (A)及淡豆豉樣品色譜圖 (B)
2.2 對照品溶液的制備
分別稱取大豆苷元、黃豆黃素及染料木素對照品適量,分別置于100mL量瓶中,加80%甲醇溶解,稀釋至刻度,搖勻,配制成濃度分別為110.7、62.6、105.5μg·mL-1對照品儲備液。
2.3 供試品溶液的制備
取淡豆豉藥材粉末2g(過80目篩),精密稱定,置于50mL錐形瓶中,加80%甲醇20mL,超聲提取2次,每次30min,濾過,用80%甲醇洗滌濾渣,置50mL量瓶中,加80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。
2.4 線性關系考察
精密吸取大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對照品貯備液各1mL,置于10mL量瓶中,并用80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液;再依次逐級稀釋制成大豆苷元、黃豆黃素、染料木素濃度為 (11.07、6.26、10.55)、(5.535、3.13、5275)、(2.214、1.252、2.120)、(1.107、0.626、1.055)、 (0.5535、0.313、0.5275)、 (0.2214、0.1252、0.212)的溶液,分別進樣1μL,以對照品的濃度X(μg·mL-1)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線,線性回歸方程見表1。
表1 3種大豆異黃酮苷元的線性回歸方程和線性范圍
2.5 精密度試驗
取混合對照品溶液 (大豆苷元2.214μg·mL-1黃豆黃素1.252μg·mL-1染料木素2.120μg·mL-1),按照上述的色譜條件連續進樣6次,以色譜峰面積計算,大豆苷元,黃豆黃素,染料木素的 RSD分別為0.52%,0.62%,0.71%,表明儀器的精密度良好。
2.6 穩定性試驗
取同一供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,12 h進樣,測得峰面積,計算得大豆苷元,黃豆黃素,染料木素峰面積的RSD分別為0.49% ,1.34% ,0.67% 。表明供試品溶液在12 h內基本穩定。
2.7 重復性試驗
取同一批淡豆豉藥材樣品 (090927)2g,共6份,精密稱定,按照2.3項下方法制備供試品溶液并測定,計算待測成分平均含量 (RSD%),分別為大豆苷元137.7μg·g-1(1.34%),黃豆黃素 29.69μg·g-1(2.83%),染料木素128.8μg·g-1(2.05%),表明本方法重復性良好。
2.8 回收率試驗
精密稱取已測知含量的樣品 (090927)約2.0 g,共9份,分為3組,分別精密加入大豆苷元貯備液 (110.7μg·mL-1)2.0、2.5、3.0mL,黃豆黃素貯備液 (62.6μg·mL-1)0.75、1.0、1.25mL及染料木素貯備液 (105.5μg·mL-1)2.0、2.5、3.0mL,按照2.3項下方法制備供試溶液,按上述色譜條件測定,分別計算回收率。其平均回收率及 RSD值分別為 100.5% (3.87%)、99.06%(2.26%)、97.84%(1.60%)。
2.9 樣品測定
取不同批次的淡豆豉樣品粉末2g,精密稱定,各3份,按照2.3項下方法制備供試品溶液,進樣分析,計算3種異黃酮苷元的含量,結果見表2。
表2 淡豆豉藥材中大豆苷元,黃豆黃素,染料木素的測定結果(X/μg·g-1± SD)
3.1 色譜條件選擇 分別比較了甲醇-水、乙腈-水體系和甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水體系,甲醇-水、乙腈-水體系中異黃酮色譜峰形稍顯拖尾,而甲醇-甲酸水,乙腈-甲酸水體系中色譜峰形對稱。經優化選擇乙腈-0.1%甲酸水 (24:76)為流動相,在此色譜條件下3種異黃酮成分色譜峰均達到基線分離,峰形對稱,大豆苷元、黃豆黃毒、染料木素的保留時間分別為2.35、2.72、4.50min,樣品分析時間為5min。本文建立的UPLC測定淡豆豉中異黃酮苷元的方法與普通HPLC法[7-9]比較,分析速度提高了5~8倍,同時也具有良好的準確度、精密度和耐用性。3.2 供試品制備方法的選擇 選擇簡便的超聲處理(250W,50KHz)方式提取淡豆豉中異黃酮苷,對提取溶劑(40%甲醇,80%甲醇、甲醇)、提取次數 (1、2、3次)進行考察,以80%甲醇超聲處理2次,可將淡豆豉中異黃酮苷元提取完全。
淡豆豉中大豆異黃酮的含量測定,文獻報道中主要對大豆苷元 (大豆黃素)和染料木素進行測定,本文建立的同時測定大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種異黃酮類成分的快速測定方法,為更好地評價和研究淡豆豉藥材的質量提供了新方法。
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