不同能量蛋白水平對綿羊睪丸生精細胞凋亡及相關基因表達的影響

徐晶晶，張春香，任有蛇，岳文斌

（山西農業大學 動物科技學院，山西 太谷030801）

細胞凋亡（apoptosis）又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是由基因主導的細胞自主性消亡過程。目前已經證實，睪丸生殖細胞的凋亡與其他細胞的凋亡機制相似，是由多基因參與的復雜過程。Bcl－2家族在細胞凋亡調控中有重要作用，是影響細胞凋亡的關鍵因素之一。Bcl－2和Bax分別是Bcl－2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡的基因。并且Bax是Bcl－2活性的主要調控因子［1］。研究發現外源營養物質可以調控哺乳動物的生殖細胞發育，并且有大量證據證明不同日糧蛋白水平對動物的生長性能、繁殖性能、精液品質是有影響的［2～6］。本試驗利用能量和蛋白質水平同步變化的日糧飼喂綿羔羊，探討日糧中不同能量蛋白水平對綿羊生精細胞凋亡的影響以及Bcl－2和Bax在此過程中的作用，旨在為通過營養調控手段提高綿羊生殖機能提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

在山西萬榮昌肉羊養殖專業合作社選擇18只健康狀況良好、體重相似的杜泊×小尾寒羊（杜×?。╇s種未去勢公羔。

1.2 試驗設計及日糧配方

在10天的適應期后，將18只羔羊隨機分配到飼喂能量蛋白水平不同的3組中：100%自由采食組、65%采食組和35%采食組。日糧組成符合NRC標準（2007）。試驗基礎日糧配方及其營養水平見表1。

表1 試驗基礎日糧配方及其營養水平Table 1 Composition and nutrient level of basis diet in this study

1.3 飼養管理

試驗于2010年6月～2010年8月在山西萬榮昌肉羊養殖專業合作社進行，篩選出的羔羊在試驗開始之前進行驅蟲處理，并將其單獨飼喂于配有料槽和水源的3m2的欄中。每天8∶00飼喂一次，自由飲水。每日晨飼前清除料槽內剩料并稱重，保證自由采食組剩料約為飼喂量的10%，并根據前一天自由采食組的采食量計算限飼組每天的飼喂量，每天單獨采集飼料和剩料樣品（總量的10%采樣）保存，然后將這些樣品按照每只羊混合為總樣品，55℃干燥至少72h，經過1mm孔篩粉碎，保存待測樣品。試驗羊每周稱重一次。各組飼養水平見表2。

表2 試驗各處理組的飼養水平Table 2 Feeding levels of the lambs in different treatments

1.4 屠宰取樣

當100%自由采食組公羔體重達到35kg，所有的羔羊禁食禁水16h后，頸靜脈放血屠宰，取睪丸組織保存備用。

1.5 檢測方法

1.5.1 Bcl－2與Bax mRNA表達的檢測

以B2 M 為看家基因，引用Shi等［7］設計的Bcl－2和Bax引物信息，在北京六合華大基因科技股份有限公司重新合成。根據TaKaRa SYBR PrimeScript RT－kit試劑盒進行反轉錄及PCR擴增，并且逐步優化反應體系，調整cDNA濃度和引物退火溫度，篩選出目的基因與內參基因引物的最佳反應條件。試驗得出Bcl－2和Bax引物的最適退火溫度分別是54℃和56℃。隨后進行所有樣品目的基因的檢測。數據分析采用SPSS18.0統計分析軟件進行各組之間的方差分析，分析結果進行顯著性檢驗，顯著性水平為0.05。

表3 Real－time PCR引物序列信息Table 3 Primer sequences for real－time PCR in this study

1.5.2 細胞凋亡檢測

試驗前玻片預先用多聚賴氨酸或APES進行處理，常規石蠟制片法制片，片厚5μm。用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測凋亡細胞。原位細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，過程按使用說明書，即切片常規脫蠟至水，用3%H2O2室溫10min，蒸餾水洗5min×3次。標本片加0.01 mol·L－1TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K濕盒中37℃消化1～15min，0.01mol·L－1TBS洗滌2min×3次。標本片加標記緩沖液，以保證切片濕潤。每張切片加緩沖液（TdT、DIG－d－UTP各1μL，標記緩沖液18μL），濕盒中37℃標記2h，TBS洗。滴加封閉液，室溫放置30min，甩掉封閉液，不洗。加抗體稀釋液1∶100稀釋的生物素化抗地高辛抗體，濕盒中37℃反應30min，TBS洗。加抗體稀釋液1∶100稀釋的SABC，濕盒中37℃反應30min，TBS洗。DAB顯色10～30min，水洗。蘇木精輕度復染，洗滌后脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察，陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色。每個個體在顯微鏡下取至少5個視野進行拍照，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，得出每個視野中的陽性細胞數，對所得的數據用SPSS18.0軟件進行統計分析和差異顯著性檢驗。

2 試驗結果

2.1 不同能量蛋白水平對公羔睪丸中Bcl－2 mR NA表達的影響

Bcl－2基因的熒光定量擴增曲線如圖1所示。由圖2可以看出，不同能量蛋白水平組的公羊睪丸中，Bcl－2mRNA在65%采食組的表達量最低，在35%采食組中的表達量最高。35%采食組中的Bcl－2mRNA 表達量顯著高于65%采食組和100%自由采食組（P＜0.05），雖然100%自由采食組的表達量高于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＜0.05）。

圖1 Bcl－2和B2 M 的擴增動力學曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.1 The PCR amplification plots（A）and dissociation curve（B）for Bcl－2and B2 M

圖2 各組羔羊睪丸中Bcl－2mRNA表達Fig.2 Bcl－2mRNA expressions in the lambs in different treatments

2.2 不同能量蛋白水平對公羔睪丸中Bax mR NA表達的影響

Bax基因的熒光定量擴增曲線如圖3所示。各處理組中Bax mRNA的表達如圖4所示，Bax mRNA在100%自由采食組表達量最低，在35%采食組中表達量最高。35%采食組中的Bax mRNA表達量顯著高于65%采食組和100%自由采食組（P＜0.05），雖然100%自由采食組的表達量低于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 Bax和B2 M 的擴增動力學曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.3 The PCR amplification plots（A）and dissociation curve（B）for Baxand B2 M

圖4 各組羔羊睪丸中Bax mRNA表達Fig.4 Bax mRNA expressions in the lambs in different treatments

2.3 不同能量蛋白水平對公羔睪丸生精細胞凋的影響亡

由圖5可以看出，35%采食組羔羊睪丸中的凋亡細胞數量最多，100%自由采食組中凋亡細胞數量最少。35%采食組中的凋亡細胞數量顯著高于65%采食組和100%采食組（P＜0.05）。雖然100%自由采食組的凋亡數量低于65%采食組，但兩者之間并無顯著差異（P＞0.05）。

從TUNEL結果（圖6）可以看出，35%采食組細胞凋亡發生在精子產生的各個階段，曲細精管中未見成熟精子。而65%采食組和100%自由采食組凋亡的細胞主要發生在精原細胞和初級精母細胞中，曲細精管中能清晰看到成熟的精子，且隨著能量蛋白增加，精子數量有增加趨勢。

圖5 各組羔羊睪丸中的細胞凋亡數量Fig.5 Apoptotic cells in testis of the kids in different treatments

3 結論與討論

圖6 各處理組綿羊睪丸TUNEL結果Fig.6 TUNEL in testis of the kids in different treatments

研究發現，環境中一些不利因素如營養缺乏可導致正常組織細胞凋亡。王全溪等［9］在飼料中添加不同含量的鋅，得出鋅含量過低或過高都能夠誘導雛番鴨免疫器官細胞凋亡。Fraker［10］曾用缺鋅飼料喂養小鼠，7周后發現胸腺萎縮殆盡。有證據證明不同日糧水平對動物的生長性能、繁殖性能和精 液 品 質 等 是 有 影 響 的［2～6］。景 煒 等［4］研 究 日 糧不同能量和蛋白水平對多浪羊繁殖性能及血液生化指標的影響，得出提高日糧能量水平對多浪羊春季發情率的提高有明顯效果。李靜［11］在研究日糧能量、蛋白水平對遼寧絨山羊種公羊精液品質和產絨性能的影響中得出日糧高蛋白水平可顯著提高采精量和精液密度，極顯著提高有效精子數和冷凍精液生產數量。劉洪波［12］研究日糧維生素E水平對羊精液品質的影響，得出日糧中添加適宜劑量的維生素E有助于提高綿、山羊采精量、精子密度和鮮精活率。根據以上證據推測日糧水平可以調控生精細胞的凋亡。本試驗驗證了這一推論。試驗結果表明，不同能量蛋白水平飼喂下，35%采食組綿羊生精細胞凋亡數量最多，表現在精子形成的各個階段，曲細精管中未見成熟精子。65%采食組和100%自由采食組綿羊生精細胞凋亡數量較少，凋亡主要發生在精原細胞和初級精母細胞中，曲細精管中成熟的精子清晰可見。因此不同能量蛋白水平是可以影響綿羊睪丸生精細胞的凋亡。

Kerr等［7］于1972年首先提出細胞凋亡，指有核細胞在特定條件下通過啟動內部機制，經過一連串的細胞變性，最終發生死亡的過程。睪丸生殖細胞的凋亡與體細胞的增殖分化一樣受多種基因調控［8］。Bcl－2基因家族是細胞凋亡的重要調控基因。根據基因在細胞生長發育中所起的作用不同將Bcl－2家族的基因分為兩類：一類是細胞凋亡促進基因，一類是細胞凋亡抑制基因。1993年Oltvai等［13］首先發現Bax基因，它是Bcl－2家族的新成員，編碼的Bax蛋白是重要的促細胞凋亡因子，能對抗Bcl－2的生物學活性，過量表達可誘導細胞凋亡。一般認為Bax主要誘導凋亡，而Bcl－2則抑制凋亡，二者是互為相關調節基因［14］。兩者表達水平間的平衡決定著細胞的生死存亡［15］。近年來的研究提示，Bcl－2和Bax這兩種基因均參與了生精細胞凋亡的過程。

為了探討日糧不同能量蛋白水平對生精細胞凋亡的影響，本試驗選取了Bcl－2，Bax作為凋亡的指標。Bax作為細胞凋亡的促進基因，其表達量隨著日糧能量蛋白水平下調而增加，說明日糧能量蛋白水平越低細胞凋亡數量越多，這與TUNEL的結果是相吻合的。而Bcl－2作為細胞凋亡抑制基因，低能量蛋白水平下表達量增加，可能原因是日糧能量蛋白缺乏，導致精子發生過程中生精細胞大量凋亡，從而致使Bcl－2過量表達來抑制細胞凋亡。這樣的結果驗證了Vandaele等［16］得出的結論：Bcl－2的表達量并不能作為細胞凋亡的標志。因此，不同能量蛋白水平可以影響綿羊睪丸生精細胞凋亡，而Bcl－2和Bax參與了凋亡調控過程。

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