BHK21細胞在新型微載體培養系統生長條件優化

王進產 焦金波 何翠 張海洋 喬榮岑 白朝勇 孫進忠

摘 要：目的：使用BelloCell-500AP生物反應器和BioNOC?-II 微載體，對BHK21細胞在此新型高密度培養生物反應器中的生長特性進行研究。方法：首先將1.5×108個BHK21細胞懸液加入含有微載體的生物反應器內，按生物反應器廠家推薦參數進行培養，每天取載體計數觀察BHK21的生長特性。然后調整細胞濃度和微載體培養系統運行參數。結果：BHK21細胞經過6 d培養載體中細胞總數達到峰值，細胞密度是起始接入數量的31倍為4.41×109個；經過培養過程參數優化，確定適于BHK21細胞高密度培養參數。試驗成功實現了BHK21細胞的高密度培養，為以BHK21細胞為生產基質的病毒疫苗生產提供了一條簡便快捷的途徑。

關鍵詞：生物反應器 微載體 BHK21細胞

中圖分類號：S852．659 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2012）12（b）-00-02

目前我國獸醫生物制品生產過程中，細胞培養設備相對比較落后，大多是在轉瓶內旋轉貼壁培養，不僅勞動強度大、操作復雜、容易造成污染，還經常出現細胞貼壁不均造成不同批次細胞的差異。為了提高產量，只有通過增加培養轉瓶數，而這往往受到生產場地的限制，而生物反應器就彌補了這些不足。BelloCell-500AP是美國Cesco公司研發的一種能有效地使細胞內外營養和氣體交換的新型固定床式生物反應器。在國內外該生物反應器已經廣泛應用于HEK 293、Vero、CHO、SF-9、ST等多種哺乳動物細胞和昆蟲細胞的培養[1-8]。BHK21細胞廣泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙腦病毒等病毒疫苗的生產基質，BHK21細胞在純懸浮培養系統和攪拌式微載體培養系統的報道比較多。本研究使用新型潮汐式固定床微載體培養系統BelloCell-500AP和BioNOC -II 片狀微載體對BHK21在微載體生長特性進行研究，探索細胞增殖規律，為口蹄疫、狂犬病毒、乙腦病毒在這一新型反應器培養工藝研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BHK21細胞（中國獸醫藥品監察所），DMEM培養基（Gibco），胎牛血清（PAA），葡萄糖（Sigma），BelloCell-500AP高密度細胞培養系統（CESCO）

1.2 試驗方法

1.2.1 微載體培養BHK21細胞方法（1）細胞的接種后貼壁階段將長滿單層BHK21細胞轉瓶消化后計數，取1.5×108顆細胞于30 mL培養基內備用，將470 mL含5% FBS的DMEM倒入BelloCell-500AP中，然后將準備好的BHK21細胞均勻地加入載體上，然后置于BelloStage機器，啟動吸附程序。

（2）細胞的接種后培養階段 吸附結束后啟動培養程序，24 h后無菌條件下將載體瓶與2 L儲液罐連接，啟動換液程序。

1.2.2 細胞在微載體培養過程的培養參數的檢測

（1）細胞核染色計數

從BelloCell-500AP取6片載體分裝于3個含CVD（結晶紫、Triton X-100、EDTA）的1.5 mL EP管中，每管分裝2片。震蕩1 min后，將其置于37 ℃孵育，每隔15～20 min震蕩1次，60 min后取出PBS作2～50倍稀釋，取10 μL于細胞計數板加樣孔進行計數，計算3個EP管中載體上的細胞總數，然后計算出每片載體片上的細胞數，根據Bellocell-500含有載體數（約865±5片）計算1個載體瓶所細胞總數。

（2）細胞狀態和生長密度

從BelloCell-500AP取含有細胞的載體片放入已含95%酒精的1.5 mL離心管中浸泡5 min，將細胞脫水并固定，棄去95%酒精并以PBS洗滌一次，然后加入H&E（Hematoxylin）染色劑染10 min用超純水沖洗，將載體置于顯微鏡下觀察細胞在微載體成長狀態和密度。

（3）培養過程中pH值

無菌條件下分別從BelloCell-500AP和2 L儲液罐取出少量液體，酸度計測定其pH值，根據pH值的高低分析細胞增殖對培養基酸堿度的影響，進而根據pH變化決定試驗結束時間。

1.3 細胞在微載體培養過程中培養條件的優化

1.3.1 細胞接種數量對微載體培養系統下BHK21細胞生長特性的影響細胞接種濃度分別為：（1）1×108個/500 mL，（2）1.5×108個/500 mL），（3）3×108個/500 mL，其他培養參數同1.2.3中步驟，觀察細胞接種密度對細胞增殖特性的影響。

1.3.2 微載體培養系統運行參數對BHK21細胞貼壁的影響微載體培養系統細胞貼壁階段運行時分別于細胞接種后2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h取出6片載體按1.3.1中的方法對載體中細胞進行計數，根據載體中細胞數和接入的細胞總數，計算不同貼壁時間細胞與載體的吸附情況。

1.3.3 微載體培養系統運行參數對BHK21細胞增殖特性的影響

（1）培養液流速對細胞增殖的影響 微載體培養系統細胞培養階段，培養液流動速率分別設定為1 mm/s、2 mm/s、4 mm/s，其他培養參數同1.2.3中步驟，觀察細胞接種密度對細胞增殖特性的影響。

（2）頂部停留時間對細胞增殖的影響 微載體培養系統細胞培養階段，液體在載體罐（BelloCell-500AP）頂部停留時間分別為0 s、10 s和30 s，其他培養參數同1.2.3中步驟，觀察其對細胞增殖的影響。

2 結果與討論

2.1 不同培養時間細胞染色觀察

不同培養時間的載體片經固定和H&E（Hematoxylin）染色后發現細胞接種后24 h在載體纖維狀的基質上有少量散在細胞，并在培養初期（0～96 h）絕大部分細胞是沿著基質增殖的，到96 h細胞已經鋪滿整個基質見圖1A （94 h），隨后細胞增殖主要發生在載體基質與基質之間，并在144 h細胞已鋪滿整個載體，見圖1的B。

2.2 BHK21細胞在BelloCell-500AP中生長特性

BelloCell -500AP起始細胞接種量為1.5×108，經過6 d培養，BelloCell-500AP載體內細胞數通過CVD細胞核染色計數達最高細胞密度是起始密度的31.73倍。細胞接入24 h內細胞增殖較慢，在細胞接種后24～96 h細胞進入快速增殖期。細胞接入接種96 h時載體內細胞總數為3.28×109，是起始密度的23.60倍。隨后細胞增殖放緩，細胞培養120 h時載體上細胞總數僅為96 h的1.26倍，細胞培養144 h載體上的細胞數為120 h的1.07倍。由于此時載體瓶中的pH值已經降至7.0以下，試驗結束。

2.3 細胞接種密度對細胞生長特性的影響

在生物反應器培養固定化細胞的培養過程中，所接種細胞量亦是影響所培養細胞生長濃度的關鍵影響因素，探討片狀載體材料用于培養BHK21細胞時細胞承載量，貼附于固定化載體材料上細胞密度的多寡，亦是之后細胞大量復制生長濃度高低的重要因素。在此試驗中設計了3組不同細胞接種濃度在生物反應器生長曲線見圖2所示。

圖2 不同細胞接種量對BHK21細胞生長的

影響

由圖可以看以第2組和第3組生長曲線比較接近，兩者在經過144 h培養后發現兩則的細胞數依然很接近，分別為，42.24×108和44.14×108顆細胞。而接種密度最低的第1組培養144h的細胞總數僅為32.47×108，遠低于另兩組。細胞接種數量少，細胞種準備相對容易，因此細胞接種密度為1.5×108個/500 mL時，更適于BHK21細胞在微載體培養系統增值。

2.4 細胞貼壁程序運行時間對BHK21細胞貼壁的影響

BHK21細胞在載體表面上增殖生長主要可以分為貼壁、生長與擴展成單層三個階段 ，其中哺乳動物細胞貼壁階段是決定細胞是否得以大量復制生長的關鍵。在本試驗設定的5貼壁程序運行時間，時間越長吸附到載體上的細胞數也越多，但到細胞貼壁階段運行3.5 h和4 h，細胞與載體的吸附率差異很小，兩者的貼附效率為92%和93%。為縮短細胞培養時間，選擇3.5 h貼壁程序運行時間更為合適。

2.5 微載體培養過程中培養液流速對BHK21細胞增殖的影響

培養基流速大小是造成細胞培養系統生物反應器剪切力大小的關鍵因素，本試驗在微載體培養時使用3種不同培養液液流速，在接種密度均為1.5×108個BHK21細胞的生長曲線見圖3。

圖3 不同培養液流速對細胞增殖的影響

由圖可以看出，不同培養液流速對細胞培養早期（0-72 h）細胞生長速度影響很小。培養液流速1 mm/s和2 mm/s的載微載體生物反應器在細胞培養72 h計數算細胞總數分別為23.7×108個/500 mL和23.4×108個/500 mL，培養液流速為4 mm/s載體瓶中算得的細胞略低，為20.7×108個/500 mL。72 h后不同培養液流速對細胞增殖的影響增加，培養基流速為4 mm/s的載體瓶細胞增殖變緩。培養基流速為2 mm/s的載體瓶中在培養144 h計算出的細胞總數略多于培養基流速為1 mm/s的載體瓶，前者最大細胞密度為46.5×108/500 mL，而培養液流速為1 mm/s條件下BHK21的峰值為43.4×108/500 mL。因此、培養BHK21細胞在微載體生物反應器培養時培養液流速為2 mm/s更合適。

2.6 微載體培養過程中培養液在載體瓶頂部停留時間對BHK21細胞增殖的影響

設計了3組分別為（1）0 s、（2）10 s和（3）30 s 不同頂部停留時間來進行試驗。當培養液在BelloCell-500AP頂部停留時，載體完全沒培養液下方，貼附于載體上 BHK21細胞能充分吸收培養液中的養分，但在同時BHK21細胞確無法獲得足夠的氧氣且代謝物停留也會影響細胞生長，因此培養液在BelloCell-500AP頂部停留時間的長短也是影響細胞生長的重要因素之一。本試驗設定微載體培養系統不同頂部停留時間對BHK21細胞生長影響的試驗結果

見圖4。

圖4 不同培養液停留時間

對細胞增殖的影響

根據圖4可看出，營養液頂部停留時間為0 s和10 s時細胞增殖曲線比較接近。但后者培養144 h具有更大的細胞密度為42.77×108個/500 mL。頂部停留時間為30s時，在培養初期（72 h前）細胞生長的速度比另兩組快，但72 h后生長速率明顯放緩，并且培養144 h最大細胞數為37.53×108個/500 mL。因此，培養液停留10 s時 細胞表現出教佳生長速度。

參考文獻

[1] Ho L，Greene CL，Schmidt AW，and et al.Cultivation of HEK 293 cell line and production of a member of the superfamily of G-protein coupled receptors for drug discovery applications using a highly efficient novel bioreactor）[J].Cytotechnology，2004.

[2] 鄭云程，吳建虹，孫奮勇，等.利用一種新型反應器—BelloCcll培養動物細胞[J].生物學雜志，2010.

[3] 馬良，田宇婧，周建民，等.采用潮汐式生物反應器進行ST細胞培養的研究[J]. 中國農學通報，2012.