病毒感染對細胞凋亡的影響及作用機制

賈 寧，孫榮釗

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

細胞凋亡是機體在生理條件下受到內外信號刺激時，啟動由細胞本身主動調控的具有一定程序的死亡，故又稱程序性細胞死（programmedcelldeath，PCD）。在多細胞生物當中，細胞的死亡有兩種不同的方式：一種是壞死性或事故性損傷，它是由于某些外界的因素，如貧血、理化因素、缺氧、pH值低下、高熱或其他理化創傷因子的作用下造成細胞急速死亡而造成不可逆的損傷；另一種溫和的細胞死亡形式稱為細胞凋亡，它是由基因編碼的細胞程序性死亡過程。細胞凋亡是機體對外界刺激進行的主動應答，這對于維持機體內環境穩定、免疫系統正常功能、調控機體發育等具有著重要意義。

1972年Kerr等[1]首先用細胞凋亡（apoptosis）這一術語來描述細胞死亡的另一種方式，其在發生機制和形態特征上與細胞壞死（necrosis）不同。越來越多的資料表明病毒感染能誘導宿主細胞凋亡[2]。病毒誘導細胞發生凋亡，限制病毒復制，可以看作宿主一種細胞水平的病毒防御機制；病毒基因或因病毒感染誘導表達的細胞蛋白抑制了凋亡，造成持續性感染以及潛伏感染，導致機體長期帶毒而無明顯的臨床癥狀。

1981年Ezoe等[3]用能產生Cyt/Dey的腺病毒突變體感染細胞，伴隨著宿主細胞和病毒DNA降解，細胞迅速死亡，這是病毒感染誘導細胞凋亡研究的首次報道。試驗表明：病毒感染誘發的細胞凋亡常與一些疾病的發生密切相關。因此，研究病毒感染宿主細胞后調節細胞凋亡的機制不僅有助于深入理解病毒的致病機理和開發新的抗病毒制劑，還為探索細胞內分子事件打開了窗口。這些研究對治療人類病毒性疾病意義深遠。

1 細胞凋亡的功能

細胞凋亡的主要功能是清除那些對整個機體有害的細胞，為抵抗病毒感染和癌癥發生提供一種機制。病毒感染細胞通常被病毒專一性淋巴細胞或由某些細胞因子啟動的細胞凋亡程序識別并摧毀。一些病毒在感染期間直接誘導細胞凋亡。與此同時，許多病毒為了有利于自身的復制而得到更多的子代，已進化出阻礙細胞凋亡并延長宿主細胞歷期的機制。由于病毒是一類分子生物，病毒蛋白以分子形式參與細胞凋亡的調控，利用病毒與細胞相互作用研究細胞凋亡調控的生化途徑具有重要意義。

2 病毒感染調控細胞凋亡的機制

一般來說，病毒調節靶細胞凋亡的途徑主要有兩種：經免疫系統介導或病毒本身具有凋亡調節基因；病毒凋亡調節基因通過模仿或調節細胞凋亡途徑中某些保守成份而發揮作用。細胞調亡調控的生化途徑實際上是一個信號傳導系統，對于這一系統的研究現已取得了很大進展。

2.1 經免疫系統介導細胞凋亡

病毒感染可激活CTL介導細胞凋亡，CTL對清除動物體內病毒具有重要意義。CTL主要通過兩條途徑殺死已被病毒感染的細胞。（1）通過分泌穿孔素和顆粒酶。在MHCⅠ類抗原誘導之下，CTL與被病毒感染的細胞結合，首先是穿孔素顆粒釋放，繼而進入靶細胞胞膜，在胞膜中生成小孔，顆粒酶進入靶細胞。在此過程中，顆粒酶B激活ICE樣蛋白酶，后者特異性地切斷DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs），其被切斷后引起DNA損傷后的修復障礙。同時，顆粒酶B切斷Caspase-3，產生可降解PARP（Poly（ADP-ribose）polymerase）的活性產物，PARP的活性產物又能激活Caspase-3的蛋白水解作用。（2）通過上調Fas/FasL基因表達，激活磷酸酯酶，合成神經酰胺，神經酰胺進一步激活絲/蘇蛋白激酶，通過信號轉導激活細胞凋亡。另據國外報道，CTL細胞上蛋白酶gzmA和gzmb及穿孔素與細胞凋亡關聯性較高，使用體外病毒免疫的CTL和具有抗Fas的EL4.F15作為靶細胞進行研究顯示：gzmA（+）或gzmb（+）的CTL誘導EL4.F15細胞出現早期凋亡特征。再者，凡有gzm介導的細胞凋亡特征均不同程度的與穿孔素有關，穿孔素明顯影響了CTL和gzm發揮作用[4]。Sabri等[5]研究發現病毒活化的CTL還可通過分泌因子誘導星形神經膠質瘤細胞發生凋亡，并且TNF-α和IFN-α對于CTL因子誘導的細胞凋亡有協同作用。

2.2 病毒直接調節凋亡

2.2.1 抑制細胞凋亡的病毒蛋白

目前已發現20種以上病毒蛋白能抑制細胞凋亡，這些病毒蛋白來源不同，調控機制各異。隨著國內外研究工作的深入，未來會發現更多的病毒蛋白能影響細胞凋亡的生化途徑（表1）。

表1 抑制細胞凋亡的病毒蛋白

2.2.2 促進細胞凋亡的病毒蛋白

病毒感染宿主細胞后，有機體的反應之一就是通過細胞凋亡清除那些被感染的有害細胞，病毒蛋白引發細胞凋亡是病毒感染過程中的普遍現象。目前已確定多種病毒蛋白能引發細胞凋亡（表2）。

表2 促進細胞凋亡的病毒和病毒蛋白

3 病毒感染相關的細胞凋亡分子

3.1 53途徑

又稱抑癌蛋白或腫瘤抑制基因，分子量為53kD，分為野生型和突變型。野生型p53促進細胞凋亡，p53突變體則抑制細胞凋亡。p53是一種轉錄調節因子，它能促進多種基因的表達，進而誘導細胞凋亡。

Devireddy等研究牛單純皰疹病毒I型感染外周血單核細胞發現，病毒感染細胞后p53數量和活性增高，并且刺激激活p21和Bax，同時激活Caspase，后者作用其底物PARP、actin及切斷抑制凋亡的Bce-lxL，誘導細胞凋亡。

KomotoS等[6]研究發現人免疫缺陷病毒Ⅰ型通過p53的表達誘導T細胞凋亡。

erradillos等[7]發現，p53雖然可以促進細胞凋亡，但不是細胞凋亡的必要條件。例如：乙型肝炎病毒的HBx蛋白誘導細胞凋亡就是非p53依賴性的。

3.2 Caspases家族

Caspase（cysteinylaspartate-specificproteinase，Caspase）譯名為半胱氨酸天冬氨酸酶，簡稱為半胱天冬酶。它是一組系列化蛋白酶的總稱，國外報道稱目前發現有13種以上，分別命名為Caspase-1、Caspase-2等，它們都是ICE/CED-3的同源物。Caspase中的“C”代表這種蛋白酶具有半胱氨酸（Cysteine）蛋白酶活性，“aspase”表示其在天冬氨酸（asparicacid）后切割蛋白。激活的Caspase可作用于其自身和其他Caspase酶原，按一定順序激活Caspase，激活的Caspase作用于不同底物，能夠加快細胞凋亡。生長因子的撤除、受體配體的作用、藥物作用及病毒感染，這些誘發細胞死亡的刺激均可激活Caspase。

現已經證實豬傳染性胃腸炎病毒通過caspase-6、caspase-7來發揮作用；雞傳染性支氣管炎病毒通過caspase-3發揮作用。CarrascosaAL等[8]證實了非洲豬瘟病毒誘導Vero細胞凋亡的過程中伴隨著caspase-3的激活。

3.3 Fas/FasL系統

Fas又稱APO-1或CD95，是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子受體（TNFR/NGFR）超家族，其與TNFR、NGFR、CD27、CD30等約有30%的同源性，FasL、屬TNF家族成員，是Ⅱ型跨膜蛋白。Fas相關蛋白（FADD）是存在于胞質中的一種蛋白質，在凋亡信號刺激下，Fas與其受體FasL結合，然后Fas的死亡域（DD）與FADD死亡域結合，誘導FADDN端的死亡效應區（DED）與pro-caspase8（或pro-caspase10）中的DED結合，形成一個新的死亡誘導信號復合物——（DISC）。該復合物能解除分子自我抑制、形成活化的異四聚體，使下游pro-Caspase水解活化，再通過一系列Caspase級聯激活反應誘導凋亡發生。

病毒感染介導細胞表達Fas/FasL，或上調Fas、FasL的表達，促進細胞凋亡。研究發現：HIV感染人巨噬細胞后，可經病毒直接作用或病毒感染產生的細胞因子及可溶性病毒蛋白間接作用，介導巨噬細胞FasL表達增加，且FasL表達程度與體內組織細胞凋亡密切相關[9]。Nicho1s等[10]分析了流感病毒感染后的淋巴細胞亞群，CD4+、CD8+、CD19+淋巴細胞均出現了凋亡，而且凋亡細胞表面高表達FasL，非凋亡細胞低表達FasL，當加入抗Fas、FasL抗體共同培養后，細胞凋亡顯著減少。流感病毒誘導細胞凋亡的機制可能是：感染刺激機體產生IFN-γ、IFN-β和dsRNA，它們均可提高Fas表達，Fas與表達在CTL或其他細胞上的FasL結合形成三聚體后，一方面依次激活蛋白激酶途徑、三磷酸肌醇和二?；视屯緩揭约扳}信號途徑激Ca2+/Mg2+依賴性核酸酶，導致DNA斷裂和染色質固縮；另一方面，通過Fas的FADD活化Caspase途徑，依次激活蛋白酶鏈裂解各種底物以誘導細胞凋亡。Shin等[11]通過HBV基因組HBX、和突變的HBX基因轉染PLC/PRF/5肝癌細胞，在HBV或HBX轉染的PLC/PRF/5細胞檢測到了FasL的表達，而突變的HBX轉染的PLC/PRF/5細胞沒有檢測到FasL的表達，證實HBV的X基因在誘導肝癌細胞FasL的表達中起了重要作用。Yoo等[12]研究發現HBX蛋白可以增強Egr-2和Egr-3的轉錄活動和反式激活功能，進而增強FasL的轉錄活性，反義Egr-2、Egr-3，可以抑制FasL的表達。另有研究發現，HBX的羧基端對于FasL和Egr的轉錄活化是必不可少的。

3.4 TRAIL

TNF相關凋亡誘導配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白，與其結合的受體有5個：DR4、DR5、DcRl、DcR2、OPG。其中，DR4和DRS被認為是轉導TRAIL凋亡信號受體，TRAIL與受體結合后可激活NF-κB、JNK通路和caspase級聯反應，進而介導細胞凋亡。Huang等[13]研究發現，雞新城疫病毒（NDV）可通過TRAIL誘導細胞凋亡。Liang等[14]通過建立3種細胞模型：肝癌細胞株BEL7402、BEL7402-HBX（將包含HBX基因的pcDANHBX轉染BEL7420獲得）和對照細胞BEL7420-cDNA（轉染了pc-DAN3的BEL7420細胞），針對HBX與TRAIL的關系進行一系列試驗，得出結論：BEL7402，BEL7402-HBX，BEL7402-cDAN3種細胞與TRAIL存在一個劑量依賴的細胞毒作用，在濃度相同的條件下，通過TRAIL處理，BEL7402-HBX的凋亡率及對capase-3的活化率比其他2種細胞具有更高水平。

以往的觀點認為TRAIL通常只引起腫瘤及轉化細胞的凋亡，對正常細胞不敏感，但最近對HIV-1研究表明，TRAIL還介導了神經元細胞和CD4+T細胞的凋亡[15]。

3.5 bcl-2基因家族

B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2，bcl-2）是凋亡研究中最受重視的癌基因之一。bcl-2家族包括抑制凋亡的bcl-2、bcl-XL、mcl-1、A1和ced-9等，促進凋亡的bax、bad和bcl-Xs等成員。它們相應的cDNA編碼Bcl-2蛋白家族均有BH1和BH2兩個高度同源序列。BH1和BH2同源結構域是Bcl-2家族成員形成同型或異型二聚體并參與細胞凋亡調節的主要結構基礎。bcl-2正常表達可使許多細胞免于凋亡，但bcl-2抑制凋亡具體作用機制尚不清楚，因受多種不同信號刺激趨于凋亡的細胞均可被bcl-2表達所補救，故推測bcl-2可能于凋亡后期某個環節發揮作用。研究表明，bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對細胞凋亡抑制或促進的關鍵因素。HIV的gp120與CD4交聯后，選擇性降低bcl-2表達，對HIV介導CD4+T細胞凋亡是必須的。Jackson等研究發現狂犬病病毒感染小鼠引起神經元Bax表達升高，使bcl-2/Bax比例失調，從而介導細胞凋亡。

3.6 TNF-α/TNFR-1途徑

腫瘤壞死因子（TNF-α）屬TNF家族成員，它是一種主要由單核巨噬細胞分泌的具有多種生物學活性的多肽調節因子。其受體TNFR1和TNFR2存在于多種細胞表面。TNFR1與Fas在結構上同源，若激活可誘導細胞凋亡。TNFR2則不參與細胞凋亡。TNF-α與TNFR1結合后，使TNFR1的死亡結構域與受體作用蛋白（RIP）和TNFR1相關蛋白（TRADD）結合，然后RIP的死亡結構域再結合RIP相關半胱氨酸同源蛋白，繼而將pro-caspase2激活，繼之激活pro-caspase8，最后通過caspase的級聯激活反應導致靶細胞凋亡。

3.7 細胞因子介導的細胞凋亡

細胞因子是免疫細胞或某些基質細胞合成的一種異質性肽類調節因子，與細胞凋亡有關的細胞因子主要有神經生長因子（NGF）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）及轉化生長因子（TGF）等[16]。

3.7.1 TGF途徑

轉化生長因子（TGF）分為TGF-α和TGF-β兩種。TGF-β既能增強某些細胞的增殖、分化能力，又能誘導某些細胞的凋亡反應。

病毒感染靶細胞后，可使TGF-β數量及活性會增高，加速了凋亡發生。Lin等[17]在對馬流感病毒感染MDCK細胞研究中發現，TGF-β1表達增加，從而激發JNK/SAPK信號途徑介導細胞凋亡。研究顯示TGF-β的凋亡與Bcl-2表達減少、caspase3表達增加有關。Schultz等[18]研究發現，流感病毒NA具有唾液酸酶作用，病毒感染細胞后，NA裂解TGF-β前體上的唾液酸殘基，釋放成熟的TGF-β，使得細胞表而或細胞外基質中TGF-β活性增強，造成細胞凋亡發生。

3.7.2 IFN途徑

IFN介導細胞凋亡最主要方式是通過激活PKR，高表達Fas來實現。IFN-γ還能誘導巨噬細胞產生NO，NO反過來又能協同IFN-γ導致巨噬細胞凋亡。Zhirnov等[19]試驗證明：病毒對IFN合成功能不同的細胞誘導凋亡的效應明顯不同，因此推測，病毒誘導細胞凋亡機制與IFN抗病毒作用機制相關聯。此外，還發現流感病毒蛋白NS1誘導細胞凋亡作用也依賴IFN。

4 結語

病毒感染能引起細胞凋亡或程序性死亡。隨著專家們對這一機制研究的深入，這種論斷已漸漸清晰。病毒感染介導細胞凋亡，是一把雙刃劍。它既是機體對周圍未感染細胞的一種保護性機制，亦是細胞在病毒感染后，一些病毒蛋白引發細胞凋亡、迅速導致宿主組織細胞損傷的重要機制。這一機制被一些科研工作者所利用，即使用一些病毒，如腺病毒、狂犬病毒、皰疹病毒等“以毒攻毒”，借助病毒裂解惡性腫瘤細胞，取得了可觀的成果。

目前，有關這方面的探索極為迅速。而開發多種新方法治療臨床一些棘手的病癥，把促進凋亡與抑制凋亡的這些病毒產物或模擬其功能的制劑應用于病毒感染不同階段，這具有非常重要的現實意義。相信在不久的將來，還會揭示更多未知的細胞凋亡調節機制，這些機制會讓人們從更全面的角度理解病毒與宿主的關系。

[1]Kerr J F R， Wyllie A H， Currie A R. Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissuekinetics[J]. Br J Cancer， 1972， 26（4）：239-257.

[2]Muller A， Rudel T. Modif i cation of host cell apoptosis by viral and bacterial pathogens[J]. Int J Med Microbiol，2001，291（3）：197-207.

[3]Ezoe H， Fatt R B L， Mak S. Degradation of intracellular DNA in KB cells IFNected with cyt mutants of human adenovirus-type-12[J]. Virol， 1981，40（1）：20-27.

[4]Pardo J， Bosque A， B rehm R，et al. Apoptotic pathways are selectively activated by granzyme A and / or granzyme B in CTL-mediated target cell lysis[J]. J Cell Biol， 2004，167（3）：457-468.

[5]Sabri F， Chiodi F， Piret J P， et al. Soluble factors released by virus specif i c activated cytotoxic T-lymphocytes induce apoptotic death of astrogliom a cell lines [J]. Brain Pathol，2003，13（2）：165-175.

[6]Komot o S， Kinomot o M，Horikos hi H，et al. Ability to induce p53 and caspase-mediated apopt osis in primary CD4+ T cells is variable among primary isolates of human im munodeficiency virus type 1[J]. AIDS Res Hum Retroviruses ， 2002，18（6）：435-446.

[7]Terradill os O， Pollcino T ， Lecoeur H， et al . p53-indepen dent apoptotic effects of the hepatitis B virus HBx protein in vivo and in vitro[J]. Oncogene， 1998，17（16）：2115-2123.

[8]Carrascosa A L， Bustos M J， Nogal M L， et al . Apoptos is induced in an early step of African swine fever virus entry into vero cells does not requir e virus replication[J]. Virology，2002，294（2）：372-382.

[9]Ashkenazi A， Dixit V M. Death receptors： signaling and modulation[J]. Science， 1998，281（5381）：1305-1308.

[10]Nichols J E， Niles J A， Roberts N J. Human lymphocyte apoptosis after exposure to IFNluenzaA virus [J]. JVirol，2001， 75（13）：5921-5929.

[11]Shin E C， Shin J S， Park J H， et al. Expression of fas ligand in human hepatom a cell lines： role of hepat itis-B v irus （HBX）in induction of Fas ligand [J]. Int J Cancer，1999，82（4）：587-591.

[12]Yoo Y G， Lee M O. Hepatitis B virus X protein induces expression of Fas ligand gene through enhancing transcriptional activity of early growth response factor[J]. J Biol Chem， 2004，279 （35）：36242-36249.

[13]Huang Y， Erdmann N， PengH， et al. The role of TNF related apoptosis -inducing ligand in neurodegenerative diseases[J].CellMol Immunol， 2005，2（2）：113-122.

[14]Liang X， SunW， Gao L，et al. Hepatit is B virus X prote inmodulates the apoptosis of hepatom a cell line induced by TRAIL [J]. Sci China C Life Sci，2005，48（3）：277-286.