一種硬性接觸鏡護理液的安全性實驗研究

金婉卿 翁郁華 陳云云 陳 浩

(溫州醫學院附屬眼視光醫院,浙江 溫州 325027)

隱形眼鏡又稱接觸鏡,根據不同材料可分為軟鏡和硬鏡。無論軟鏡還是硬鏡,隨著配戴時間的延長,鏡片都容易附著沉淀物,這些沉淀物包括淚液中的蛋白質、脂類、色素、鈣鹽以及多種微生物等,沉淀物不僅降低了鏡片的透光性、透氣性,也容易引發眼內并發癥,因此配戴接觸鏡的同時也需要對鏡片進行合理的護理。本院研制出一種硬性接觸鏡護理液,成分主要包括三氟乙酸、消毒劑、pH調節劑等,綜合了其他護理液的特點,能夠清除硬性接觸鏡表面的蛋白沉積,保持鏡片透光性。本文從刺激性、角膜細胞相容性等方面研究該護理液,從而為其安全性作出初步實驗評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔6只,體質量2.5～3.0kg,雌雄各半,由丹陽市光明實驗動物養殖場提供,合格證號:3200002369

1.1.2 試劑 硬性接觸鏡護理液(成分主要包括三氟乙酸、聚胺丙基雙胍、緩沖劑等),由本院實驗室2012年3月研制;丙酮,分析純;生理鹽水注射液(浙江康樂藥業股份有限公司);WST-1細胞毒性測試試劑盒(碧云天生物技術研究所)、DMEM/F12、FBS、0.05%Trypsin-EDTA(gibco)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人眼角膜上皮細胞培養[1]所用細胞系為ATCC CRL-11135 HCE-2,培養基為含10%FBS、5μ g/mL 胰島素 ,10ng/mL EGF,100μ g/mL 青 -鏈霉素的 DMEM/F12(1∶1)培養液,放于 37℃,5%CO2培養箱培養,待細胞生長至80%融合時以1∶4傳代培養。

1.2.2 人眼角膜細胞相容性實驗[1-2]HCE-2細胞在培養瓶中生長至80%融合后以0.05%Trypsin消化5分鐘,調整細胞濃度為4×104個/mL接種于96孔板,設正常對照組、護理液組及空白對照組三個實驗組,其中正常對照組、護理液組各加100μ L細胞液,空白對照組只加等量培養液,各組在培養箱中培養過夜,細胞貼壁后將原培養液吸出,正常對照組、空白組換為100μ L不含小牛血清的培養液繼續培養、護理液組加等量護理液。每組設5平行組,6個時間點:15分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時,分別在培養特定時間后各孔加入10μ LWST-1試劑,細胞培養箱中孵育30分鐘,用酶標儀檢測各實驗孔在450nm吸光度(opticaldensity,OD)值,按照如下公式計算護理液組細胞相對增殖率A=(護理液組吸光度值-空白組吸光度值)/(正常對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.3 一次眼刺激實驗[3-4]實驗前24小時用2%熒光素鈉染色、裂隙燈檢查兔眼,選擇無任何眼病變及炎癥的健康新西蘭白兔3只,左眼下結膜囊內滴入0.1mL硬鏡護理液,被動閉眼2秒,此組作為護理液組,同法右眼滴入等量生理鹽水,作為正常對照組。分別在滴眼后1、24、48、72小時使用裂隙燈檢查兔眼結膜、虹膜、角膜等情況,根據表1眼損傷計分系統記分。

表1 眼損傷記分系統[5]

1.2.4 多次皮膚刺激實驗[3]新西蘭大白兔3只,實驗前24小時將背脊兩側的毛用剃須刀剃去,約10cm×15cm大小區域。取2.5cm×2.5cm大小的兩層紗布塊若干,每塊紗布塊滴加0.5mL樣品溶液浸濕,按照圖1所示將紗布塊貼敷于兔子裸露皮膚處,其中2、6處皮膚貼敷護理液(護理液組),3、5處皮膚貼敷生理鹽水(正常對照組),紗布塊上覆蓋一層封口膜、兩層干紗布,最后以醫用透明敷料固定,敷用時間每天6小時,連續敷5天。每次貼敷結束后用溫水除去受試物,自第5天除去受試物后1小時、24小時、48小時和72小時觀察皮膚反應,按照2005版《醫療器械生物學評價》第10部分《刺激與遲發型超敏反應試驗》皮膚反應記分系統記分[5],按照刺激反應類型評價刺激強度。

圖1 兔子背部貼敷示意圖

1.3 統計學處理 計量資料應用SPSS 19.0軟件并采用t檢驗進行統計。

2 結 果

2.1 細胞相容性 空白對照組的設立是為了減去溶液及試劑本身的光吸收值,正常對照組與護理液組細胞同步培養,其中正常對照組細胞相對增殖率為1。護理液作用HCE-2細胞1小時,細胞相對增殖率均在80%以上,隨后1～4小時細胞活性逐漸從80%降至20%以下,作用時間延長至24小時,細胞相對增殖率逐漸降低,大部分細胞形態都收縮變圓,但仍有1/10存活,詳見圖2。三組吸光光度值的原始數據詳見表2。

圖2 硬性接觸鏡護理液對HCE-2細胞增殖的影響

表2 不同實驗組作用HCE-2細胞450nm吸光度值(OD)(,n=5)

表2 不同實驗組作用HCE-2細胞450nm吸光度值(OD)(,n=5)

組 別 15 min 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h空白對照組 0.203±0.004 0.198±0.005 0.194±0.000 0.198±0.001 0.201±0.003 0.157±0.001正常對照組 0.261±0.008 0.254±0.005 0.272±0.008 0.293±0.003 0.331±0.01 0.343±0.008護理液組 0.253±0.004 0.245±0.004 0.234±0.006 0.216±0.001 0.224±0.011 0.180±0.003

2.2 一次眼刺激實驗[6-7]給藥前以及給藥后1、24、48、72小時用裂隙燈對兔眼進行檢查,觀察眼結膜、角膜、虹膜和其他損傷,將每一觀察時間點每一動物的眼結膜、虹膜和結膜的刺激反應分值相加得總積分,將每組的總積分除以動物總數,即得刺激積分。給藥后,與臨床常用眼沖洗液生理鹽水的正常對照組比較,兩組在任何階段均未出現眼瞼水腫、分泌物增加等刺激性反應,眼部刺激積分均為0。

2.3 多次皮膚刺激實驗[6-7]連續敷貼5次后,護理液組和正常對照組在敷貼期間兔子均無異常表現,給藥后1小時兩組皮膚出現極輕微紅斑,隨著觀察時間的延長,紅斑漸漸消失。護理液組與正常對照組治療前評分均為0,敷貼后各時間點皮膚刺激評分均無顯著性差異(均P＞0.05),詳見圖3、表3。

圖3 兔皮膚刺激記分

表3 給藥后多次皮膚刺激實驗評分表(,分)

表3 給藥后多次皮膚刺激實驗評分表(,分)

組 別 n 1 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 6 0.333±0.5160.333±0.5160.333±0.5160.167±0.408護理液組 6 0.500±0.5480.333±0.5160.333±0.5160.160±0.408

3 討 論

與軟鏡一樣,硬鏡的護理也包括清潔、沖洗、消毒、貯存,目前相應的護理產品主要有多功能護理液(用于日常的護理步驟)和除蛋白液。關于這些護理產品的功效、和安全性等方面的研究較少。本院研制的一種硬性接觸鏡護理液,主要含三氟乙酸3g/L、聚胺丙基雙胍1mg/mL、緩沖劑等,為一種無色無味的澄清液體。三氟乙酸為一種強酸,可用于清除蛋白沉淀,已有研究對其最佳的除蛋白濃度做了分析[8];聚胺丙基雙胍為一種廣譜、低毒、高效的表面活性劑,在硬性接觸鏡的護理中主要起到消毒殺菌作用[9];緩沖劑則可以調節溶液的pH值和滲透壓,同時溶解其他成分,在接觸鏡護理中起到輔助作用。

在本護理液的細胞相容性實驗研究中,為了分析該護理液在眼內直接滯留對人角膜上皮細胞的影響,作者設計了與正常生長不添加任何刺激物的對照組(細胞液+培養液)進行比較,結果發現該護理液(細胞液+護理液)作用于HCE-2細胞1小時以內,細胞的相對增殖率均在 80%以上;作用2小時,細胞也有＞50%的活性;作用時間越長越不利于細胞正常生長。鐘興武等[2]早期研究了4種隱形眼鏡護理液,發現均存在對角膜上皮細胞明顯的毒性作用,細胞暴露于護理液中2小時即能達到＞60%的毒性。這說明特殊作用的接觸鏡護理液對人眼角膜上皮細胞具有一定的毒性,時間越短毒性作用越弱。所以,具有去蛋白作用的硬鏡護理液在使用時不允許直接接觸人眼,硬鏡經過護理液清除蛋白后要用基本無刺激的全功能護理液再進行沖洗和浸泡后才可以安全地佩戴入眼。該護理液也一樣,其主要用途為去蛋白、清潔、消毒鏡片,而不能直接接觸角膜。

在眼刺激實驗中,此硬性接觸鏡護理液與正常對照組(生理鹽水)一樣,對兔眼角膜、虹膜、結膜等在治療后1、24、48、72小時刺激評分均為0,說明該護理液對眼無刺激性。在皮膚多次給藥刺激實驗中,敷貼后1、24、48、72小時各時間點皮膚刺激評分與正常對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。說明此護理液對兔皮膚無刺激性,屬于皮膚非刺激物。所以,此護理液在動物眼表刺激和皮膚刺激方面均是安全的。

以上研究均停留在動物實驗研究階段,尚需結合目前臨床上使用的進口硬鏡去蛋白護理液進行深入地對照研究,以便為國產硬鏡護理液的研究生產提供動物實驗依據。

[1] Saarinen-Savolainen P,Jarvinen T,Araki-Sasaki K,et al.Evaluation of cytotoxicity of various ophthalmic drugs,eye drop excipients and cyclodextrins in an immortalized human corneal epithelial cell line.Pharmaceutical Research,1998,15(8):1275

[2] 鐘興武,龔向明,戴祖優,等.接觸鏡護理液對角膜上皮細胞毒性的研究.中國實用眼科雜志,1996,14(11):686

[3] 張笑樂,向楠,殷中瓊,等.油樟葉揮發油對兔的急性皮膚刺激、眼睛刺激和皮膚光毒性的研究.中國農學通報,2011,27(23):36

[4] 董賢慧,錢濤,高維娟,等.納他霉素滴眼劑對兔眼的刺激性研究.華西藥學雜志,2011,26(1):34

[5] GB/T 16886.10.醫療器械生物學評價(S),北京:中國食品藥品監督管理局,2005

[6] 陸龍喜,魏蘭芬,傅桂明,等.全功能隱形眼鏡護理液殺菌效果及毒性的研究.中國消毒學雜志,2005,22(1):30

[7] 魏蘭芬,朱一凡,許天新,等.一種隱形眼鏡護理液殺菌效果及毒性的研究.中國消毒學雜志,2003,20(1):27

[8] 章瑾,萬子義,南開輝,等.硬性透氣性角膜接觸鏡材料體外溶菌酶的短期吸附動力學.中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(3):473

[9] 林冬青.角膜接觸鏡的日常護理(上).中國眼鏡科技雜志,2006,(9):113