烏桕秋葉轉色前后生理特性及超微結構的變化1)

張 敏 錢 猛 倪競德 黃利斌

(江蘇省林業科學研究院，南京，211153) (南京農業大學) (江蘇省林業科學研究院)

烏桕(Sapium sebiferum(L.)Roxb.)為大戟科(Euphorbiaceae)烏桕屬植物，是集能源、藥用、材用、觀賞為一體的多用途樹種。作為長江中下游地區重要的景觀樹種之一，烏桕季相變化豐富，秋葉由綠變黃、變紅或變紫，極具觀賞價值。目前，有關烏桕開發利用［1－3］、抗逆機理［4－5］以及繁育［6－8］的研究較多，而未見其葉片呈色機理的報道。深入了解烏桕葉色變化的生理生化基礎，尋求其葉色變化的原因及影響其呈色的相關因素，對提高烏桕的觀賞價值和進行新品種選育具有重要的理論意義和參考價值。

本研究以烏桕秋葉為試材，對比研究了黃、紅兩個單株的葉片在秋季變色前后色素、氮元素、淀粉、糖等生理指標的差異及其相關性，還對葉綠體超微結構變化進行了分析，以探討烏桕秋葉的呈色規律，為選育秋季葉色純正的優良觀賞株系提供理論依據。

1 材料與方法

在連續3 a葉色調查的基礎上，選取樹齡13 a、葉色性狀穩定、生長健壯、長勢一致、秋季轉色后葉色分別為黃色和紅色的烏桕單株進行本次試驗。取樣地點位于江蘇省林業科學研究院大門口、寧丹路旁，取樣時間分別為2010年9月20日(變色前)和11月12日(變色后)10:00。黃色單株和紅色單株分別取樣，以變色前綠色葉片為對照，取樣部位及朝向基本相同。

生理生化指標測定:葉綠素質量分數測定采用丙酮乙醇混合液法［9］，花色素苷質量分數測定采用鹽酸乙醇浸提法［10］，全氮質量分數測定采用凱氏定氮法［11］，葡萄糖、果糖、蔗糖質量分數采用Roche公司(Darmstadt，Germany)Sucrose/D－Glucose/D－Fructose試劑盒測定，淀粉質量分數采用Roche公司(Darmstadt，Germany)Starch試劑盒測定。各項檢測重復3次，結果用SPSS13.0系統軟件進行數據統計分析。

葉綠體超微結構觀察:取鮮葉洗凈、擦干，快速切取1 ～2 mm2，放入 2.5% 戊二醛溶液固定，0.1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸固定。再用0.1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗。30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮系列脫水，然后包埋劑逐級滲透，包埋，聚合后用瑞典LKB－V型超薄切片機進行超薄切片，鈾鉛染色，在日立H－600型透射電子顯微鏡下觀察并拍照［12］。

2 結果與分析

2.1 烏桕秋葉變色前后色素質量分數變化

黃、紅2種類型的烏桕秋葉中總葉綠素、類胡蘿卜素、葉綠素a/b及花色素苷質量分數見表1。變色前后，2種類型秋葉中葉綠素質量分數及比值的差異較大。綠葉中總葉綠素質量分數分別為1.61、1.69 mg·g－1，均顯著高于其變色后黃葉(0.28 mg·g－1)和紅葉(0.33 mg·g－1)的質量分數(P＜0.01);但變色后黃葉和紅葉中總葉綠素質量分數無顯著差異(P＜0.05)。葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b兩種，前者呈藍綠色，后者呈黃綠色［13］。如表1所示，變色前葉綠素a和b之比略高于3;而變色后葉綠素a和b之比分別降低為1.95和1.38，說明葉綠素b的相對質量分數有所升高。

類胡蘿卜素是一類天然有色物質，是葉綠素的伴生物，在秋葉顯色中具有重要作用［14］。從表1的結果可以看出，黃色秋葉類胡蘿卜素質量分數顯著升高，比變色前綠葉提高了17.50%;而紅葉單株變色前后，葉片中類胡蘿卜素質量分數無顯著差異。

秋季變色前后，黃葉單株葉片花色素苷質量分數變化不大;而紅葉中花色素苷質量分數極顯著升高，是綠葉的13.9倍，是黃葉的3.60倍。方差分析結果表明，紅葉中花色素苷質量分數與綠葉和黃葉相比，均達到極顯著差異水平(P＜0.01)，說明花色素苷質量分數的高低是決定烏桕紅色秋葉著色的主導因素之一。

表1 烏桕秋葉變色前后色素及氮元素質量分數變化

2.2 不同單株葉片氮元素質量分數的比較

有研究表明，葉色差異與植物的氮素營養狀況密切相關［15］。從表1中可以看出，烏桕秋葉在變色后氮元素質量分數明顯降低。黃葉和紅葉中氮元素質量分數分別比變色前綠葉降低27.92%和15.75%。其中，紅葉中的氮元素質量分數最低，方差分析結果表明，不同顏色葉片中氮元素質量分數差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 烏桕秋葉變色前后糖和淀粉質量分數的變化

糖是植物體內碳水化合物運輸的主要形式，作為花色素苷的前體物質，在其合成過程中起重要作用［10］。從表2可以看出，烏桕葉片在秋季轉色后，葡萄糖質量分數極顯著降低(P＜0.01)。黃色秋葉中果糖和蔗糖質量分數分別比變色前綠葉降低了51.49%和 76.01%，差異極顯著(P＜0.01)。紅色單株的葉片在秋季轉色后，果糖質量分數顯著升高，是變色前綠葉的1.25倍(P＜0.05);蔗糖質量分數也有所提高，但方差分析結果表明差異不顯著。

淀粉是碳的主要儲存物質，其質量分數在很大程度上影響著樹木的生長及對環境的響應［16］。本研究中，黃色秋葉和紅色秋葉中淀粉質量分數均比變色前顯著降低(P＜0.01)(表2)，說明在葉片衰老過程中，光合產物儲備減少。

表2 烏桕秋葉變色前后非結構性碳水化合物質量分數的變化 mg·g－1

植物葉片中非結構性碳水化合物(TNC)是碳吸收(光合同化)與碳消耗(生長與呼吸消耗)關系的一種量度，反映了可供植物生長利用的物質水平［17］。本研究結果表明，烏桕秋葉變色后非結構性碳水化合物質量分數降低，不同顏色由高到低排序為:綠葉、紅葉、黃葉，方差分析結果表明，差異達顯著水平(P＜0.05)。

2.4 色素與相關生理指標的相關性分析

相關性分析表明(表3)，總葉綠素質量分數與氮、葡萄糖、淀粉質量分數呈顯著或極顯著正相關;類胡蘿卜素質量分數與果糖質量分數呈極顯著負相關;花色素苷質量分數與氮元素、葡萄糖、淀粉質量分數呈負相關，與果糖質量分數呈正相關，但均未達到顯著水平;花色素苷和葉綠素的比值與葡萄糖質量分數呈顯著負相關關系。

表3 色素與全氮及非結構性碳水化合物質量分數的相關系數

2.5 烏桕秋葉變色前后葉綠體超微結構分析

利用透射電鏡分別對變色前綠葉、變色后黃葉和紅葉的葉肉細胞進行觀察。結果發現黃葉單株的秋葉變色前，單位細胞內葉綠體數較多，葉綠體沿細胞壁邊緣分布，形狀呈紡錘形或橢圓形，葉綠體膜完整，界限清晰。葉綠體中基質物質濃厚，淀粉粒豐富，有少量嗜鋨顆粒(圖1－A)。黃色秋葉葉綠體數目變少，形狀不規則，體積增大，被膜邊緣模糊，有的破裂;基質片層疏松、不清晰，葉綠體中未見淀粉粒，嗜鋨顆粒增多(圖1－B)。

紅葉單株變色前葉肉細胞的葉綠體呈橢圓形，數量多，結構完整，基質片層及基粒片層清晰可見。類囊體系統發育完善，類囊體中不僅有大量的基質片層，而且基粒較多，基粒垛疊較厚，基粒片層與基質片層界限明顯，可以觀察到淀粉粒，但數量較少(圖1－C)。變為紅色后，大部分細胞器已經解體，基質中出現囊泡，個別細胞中能夠觀察到正在解體退化的基粒片層殘片。嗜鋨顆粒大量增加，聚集在一起，基質中無淀粉粒存在(圖1－D)。

圖1 烏桕秋葉葉肉細胞超微結構

3 結論與討論

色素質量分數、內含物種類以及細胞結構等因素均能影響植物葉片的呈色［18］。色素是彩葉植物葉片呈色的物質基礎，其中葉綠素、類胡蘿卜素和花色素苷是存在于葉片中的主要色素，其質量分數與比例是決定葉片呈色的主要因素［19］。烏桕秋葉在轉色過程中，不同種類的色素處于動態變化中，變色前葉綠素質量分數高，類胡蘿卜素和花色素苷質量分數較低，葉片呈綠色;隨著秋季氣溫降低，葉綠體開始解體，總葉綠素質量分數和葉綠素a質量分數顯著降低。黃葉類型烏桕秋葉中類胡蘿卜素質量分數大幅升高，葉片呈黃色;紅葉類型烏桕秋葉在葉綠素質量分數降低的同時，花色素苷合成加快，質量分數急劇升高，葉片呈紅色。不同顏色烏桕秋葉中的色素質量分數存在顯著差異，紅色單株葉片中花色素苷的質量分數遠高于黃色單株，成為烏桕秋葉呈現紅色的主要原因。

已有研究表明，葉色與全氮質量分數的變化是同步的，葉色實際上是葉片氮化合物狀況的外在表現［20］。在本試驗中，氮元素質量分數與總葉綠素質量分數呈顯著正相關，與花色素苷質量分數呈不顯著負相關。此結果與 Schaberg et al.［21］對糖槭(Acer saccharumMarsh.)秋葉的研究相一致。

對紅色起主導作用的花色素苷是由花青素和糖組成的糖苷，花青素又是在糖代謝的基礎上形成的［22］。還有報道指出，糖可作為信號物質誘導花色素苷合成基因的表達和調節酶的活性［23］，因此，糖質量分數同烏桕秋葉顯色密切相關。本研究發現，紅色秋葉中果糖和蔗糖質量分數高于變色前綠葉和黃色秋葉，表明果糖和蔗糖對烏桕葉片中花色素苷的累積有明顯的促進作用。葡萄糖質量分數與總葉綠素質量分數呈極顯著正相關，而與花色素苷質量分數呈負相關，分析原因可能是黃色和紅色秋葉在衰老過程中葉綠素質量分數降低，光合作用減弱，導致光合產物葡萄糖的積累受到影響。

碳水化合物是光合作用的主要產物，是樹木生長代謝過程中重要的能量來源。葉片同化的光合產物一部分用于構建各種組織和器官，稱為結構性碳水化合物，如木質素、纖維素等;另一部分用于生理代謝活動，稱為非結構性碳水化合物(TNC)，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等［24］。已有研究表明非結構性碳水化合物不僅在植株生命代謝中發揮重要作用，還是植物適應環境的信號物質［25－26］。烏桕秋季變色后，非結構性碳水化合物質量分數顯著降低，相關性分析表明，其質量分數與葉綠素質量分數呈正相關，與類胡蘿卜素質量分數呈負相關?？赡苁怯捎邳S色和紅色秋葉中光合色素質量分數降低，光合產物生成較少;同時類胡蘿卜素和花色素苷合成的基礎物質是糖類物質，其生成過程中也消耗了大量的非結構性碳水化合物?；ㄉ剀盏睦鄯e受激素、酶、光、pH值、溫度等多種因素的影響［27］，可能是本試驗中其與可溶性碳水化合物的相關性不明顯的原因之一。糖代謝與葉片呈色密切相關［28－29］，但其作用機制還有待于更深入細致的研究。

葉綠體是葉片進行光合作用的細胞器，也是植物葉片衰退進程中變化最靈敏的器官［30］。本研究發現，烏桕秋季葉色改變前后，葉綠體數量、形狀以及基粒片層的結構均發生了明顯變化，紅色秋葉的內部結構比黃色秋葉更趨于簡單。葉綠體中的淀粉粒是細胞碳水化合物存在的主要形式之一。從觀察結果來看，綠葉中淀粉粒數量較多，體積較大，說明其葉綠體保持著活躍的光合作用功能。而葉色變黃或變紅后，淀粉粒數量減少、體積減小，甚至消失，其原因可能是當葉綠體解體退化時，由于類囊體片層的減少，光合效率大大降低，淀粉的合成變慢，但水解速度加快，于是淀粉粒越來越小，直至最終消失［31］。烏桕秋葉變色后，嗜鋨顆粒大量增加，并聚集，這種變化與衰老葉片中退化葉綠體的結構特點相似［32］。

總之，烏桕秋季葉色的變化是在多種因素的綜合作用下完成的，最直接的原因是色素的成分和比例發生改變，而相關生理指標和葉綠體結構的變化都是秋葉呈色的重要影響因素。

［1］王洪慶，趙春陽，陳若蕓.烏桕葉化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(12):1179－1181.

［2］鄒曉霞，楊江科，劉云，等.復合酶法制備烏桕梓油生物柴油工藝優化［J］.中國油脂，2010，35(6):33－37.

［3］彭旦明，彭鎮華.楓楊、烏桕對釘螺毒性的研究［J］.應用生態學報，1995，6(3):301－304.

［4］蔡金峰，曹福亮，汪貴斌，等.淹水脅迫對烏桕幼苗葉片活性氧代謝的影響［J］.福建林學院學報，2010，30(1):51－55.

［5］曹福亮，蔡金峰，汪貴斌，等.淹水脅迫對烏桕生長及光合作用的影響［J］.林業科學，2010，46(10):57－61.

［6］金雅琴，何銳，張紀林，等.烏桕1年生播種苗生長規律［J］.東北林業大學學報，2010，38(9):10－12.

［7］李建科，楊靜慧，劉太林，等.野生烏桕的組培和再生［J］.北方園藝，2010(13):164－166.

［8］郄亞微，徐有明，李學琴，等.能源林樹種烏桕莖段離體培養與快速繁殖［J］.東北林業大學學報，2010，37(12):8－9，42.

［9］張憲政.作物生理研究法［M］.北京:農業出版社，1990，142.

［10］陳繼衛，沈朝棟，賈玉芳，等.紅楓秋冬轉色期葉色變化的生理特性［J］.浙江大學學報:農業與生命科學版，2010，36(2):181－186.

［11］王淵，黃敬峰，王福民，等.油菜葉片和冠層水平氮素含量的高光譜反射率估算模型［J］.光譜學與光譜分析，2008，28(2):273－277.

［12］袁麗釵，李雪平，彭鎮華，等.菲白竹組培苗白化、綠化突變體的超微結構及15個葉綠體編碼基因的表達［J］.植物學報，2010，45(4):451－459.

［13］王忠.植物生理學［M］.北京:中國農業出版社，2000:66.

［14］陶俊，張上隆，張良誠，等.柑橘果皮顏色的形成與類胡蘿卜素組分變化的關系［J］.植物生理與分子生物學學報，2003，29(2):121－126.

［15］王紹華，吉志軍，劉勝環，等.水稻氮素供需差與不同葉位葉片氮轉運和衰老的關系［J］.中國農業科學，2003，36(11):1261－1265.

［16］Ericsson T，Rytter L，Vapaavuori E.Physiology of carbon allocation in trees［J］.Biomass and Bioenergy，1996，11(2/3):115－127.

［17］潘慶民，韓興國，白永飛，等.植物非結構性貯藏碳水化合物的生理生態學研究進展［J］.植物學通報，2002，19(1):30－38.

［18］朱書香，楊建民，王中華，等.4種李屬彩葉植物色素含量與葉色參數的關系［J］.西北植物學報，2009，29(8):1663－1669.

［19］趙昶靈，郭華春.植物花色苷生物合成酶類的亞細胞組織研究進展［J］.西北植物學報.2007，27(8):1695－1701.

［20］王紹華，曹衛星，王強盛，等.水稻葉色分布特點與氮素營養診斷［J］.中國農業科學，2002，35(12):1461－1466.

［21］Schaberg P G，van den Berg A K，Murakami P F，et al.Factors influencing red expression in autumn foliage of sugar maple trees［J］.Tree Physiology，2003，23(5):325－333.

［22］李云飛，李彥慧，王中華，等.土壤干旱脅迫對紫葉矮櫻葉片呈色的影響［J］.生態學報，2009，29(7):3678－3684.

［23］趙玉輝，郭印山，李作軒.果實花青素研究進展［J］.北方園藝，2006(3):46－47.

［24］印婧婧，郭大立，何思源，等.內蒙古半干旱區樹木非結構性碳、氮、磷的分配格局［J］.北京大學學報，2009，45(3):519－527.

［25］Gibson S I.Plant sugar-response pathway.Part of a complex regulatory web［J］.Plant Physiol，2000，124(4):1532－1539.

［26］潘慶民，韓興國，白永飛，等.植物非結構性貯藏碳水化合物的生理生態學研究進展［J］.植物學通報，2002，19(1):30－38.

［27］Tomas-Barheran F A，Robins R J.Phytoehemisty of fruits and vegetables［M］.Oxford:Clarendon Press，1999:29－49.

［28］唐前瑞，陳德富，陳友云，等.紅檵木葉色變化的生理生化研究［J］.林業科學，2006，42(2):111－115.

［29］胡靜靜，沈向，李雪飛，等.黃連木秋季葉色變化與可溶性糖和礦質元素的關系［J］.林業科學，2010，46(2):80－86.

［30］魏曉東，陳國祥，徐艷麗，等.銀杏葉片衰老過程中光合生理特性及葉綠體超微結構的變化［J］.植物研究，2008，28(4):433－437.

［31］范燕萍，李慧玲，李浩健.幾種花葉線藝蘭葉片色斑色素組成和葉綠體超微結構研究［J］.華南農業大學學報，2006，27(2):8－12.

［32］雷華，陳國祥，高志萍，等.兩優培九劍葉葉綠體衰退進程中的細胞生物學特性初探［J］.中國水稻科學，2008，22(3):279－284.