培養液組胺的檢測及鰹魚產組胺菌的生物活性評價

周秀錦，楊 建，周向陽，沈 飚，吳祖芳

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316100；2.應用海洋生物技術教育部重點實驗室，寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江寧波 315211)

鰹魚(Eleotridae)，俗稱為炸彈魚，屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、鰹屬，我國只產一種；鰹魚肉中含有豐富的血紅蛋白和肌紅蛋白，在有生命活動的組織內，血紅蛋白與肌紅蛋白處于平衡狀態，而魚體死后經氧化生成的高鐵肌紅蛋白則呈現不良的棕紅色[1]。一般認為，肌紅蛋白的化學狀態是影響魚肉顏色的根本所在[2]。同時由于魚肉中的組氨酸在組胺細菌脫羧酶的作用下，發生脫羧反應生成組胺[3]。海水中存有污染魚類的組胺菌，組胺生成菌普遍存在于海水魚的體表，也生活在活魚的鰓和內臟中。魚死亡時，在貯藏或加工過程中體內組氨酸經過內源性或外源性微生物產生的脫羧酸酶降解后產生的對產品品質(感官指標)劣化或人體有一定毒害的化學物質[4]。鰹魚罐頭是我國某些沿海城市重要的出口水產加工品，暢銷日本、歐洲等國家；自中國加入世界貿易組織，出口量不斷增加，但是組胺含量超標，一直是制約產品出口的主要瓶頸，因組胺含量超標而引起的中毒事件也時有發生[5-7]。本文建立了培養基中組胺的高效液相色譜法(HPLC)檢測方法，確定從鰹魚魚肉組織中分離產組胺微生物，研究菌株的生長和產組胺特性，研究結果可為冷凍水產品組胺含量相關的質量安全控制提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

冷凍鰹魚(捕撈于中國東海，捕撈后于-30℃下速凍，-18℃保藏)，浙江舟山企業提供(2010年4月)，無菌袋包裝、冷藏，于5 h內運到實驗室，-18℃保藏，以備試驗用。

組胺標準品購自Sigma公司，丹磺酰氯購自ACROS公司，L-組氨酸和1,7-二氨基庚烷購自阿拉丁試劑公司，乙腈和甲醇購自迪馬公司；色譜分析所用試劑：色譜純；其他試劑：均為化學純和分析純。

組胺發酵培養基：L-組氨酸10 g，大豆蛋白胨17g，NaCl 3.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，丙酮酸鈉10.0 g，葡萄糖2.5 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 7.0，分裝試管。培養基于1.01×105Pa高壓下，121℃蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

LRH-190-S恒溫恒濕培養箱，購自廣東省醫療器械廠；LDZX-40BI立式蒸汽滅菌鍋，購自上海申安醫療器械廠；安捷倫LC1100液相色譜儀，購自美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養液中組胺檢測方法的建立

1.3.1.1 發酵液預處理

取各菌株發酵液及空白對照各1 mL于5 mL離心管，依次加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉，20 μL 100 mg/L 1,7-二氨基庚烷(內標物，用0.1 mol/L鹽酸配制而成)標準使用液，300 μL飽和碳酸氫鈉，再加入2 mL丹酰氯衍生劑溶液(用色譜級丙酮配制成濃度為10 mg/mL)進行衍生，震蕩混勻后于60℃烘箱內放置45 min，再加入100 μL氨水放置40 min，最后用乙腈定容至5 mL，震蕩混勻，取1 mL經0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3.1.2 標準曲線預處理

取 0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL 的 10 μg/mL 組胺標準溶液，經 1.3.1.2 加入 20 μL 100 mg/L 1,7-二氨基庚烷……衍生處理后，通過高效液相測定。

1.3.1.3

色譜條件：流動相A：0.01 mol/L乙酸銨，流動相B：乙腈與0.01 mol/L乙酸銨9:1混合；流動相A：流動相B=2:8，流速1.0 mL/min，紫外檢測器波長254 nm，進樣量20 μL。

1.3.2 待測菌株產組胺能力的測定

取1 mL初步分離菌株菌懸液接種于9 mL組胺發酵培養基中(此時菌液濃度約為104 CFU/mL)，并設置空白對照組(不接種菌株)，35℃下靜置恒溫培養36 h，檢測發酵液是否有組胺產生。

1.3.3 溫度對產組胺菌株生長和產組胺的影響

取1 mL產組胺菌株的菌懸液接種至9 mL組胺發酵培養基中，分成五組分別于4℃、20℃、25℃、30℃和35℃下靜置培養36 h，每個溫度均設置空白對照；取1 mL通過高效液相色譜法測定組胺含量。

1.3.4 pH對產組胺菌株生長和產組胺的影響

取1 mL菌懸液接種于9 mL pH為4，5，6，7和8的組胺發酵培養基中(每個pH設置空白對照)，30℃培養箱中靜置培養36 h；測定發酵液中的組胺含量。

2 結果與分析

2.1 培養液中組胺檢測方法的建立

2.1.1 樣品前處理的優化

在樣品處理過程中加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，調整培養液pH呈堿性，致使組胺能游離便于衍生。衍生化后添加乙腈，充分沉淀培養液中的蛋白質，減少待測液中的大分子物質，保護檢測系統的穩定，延長色譜柱的使用壽命。

2.1.2 標準工作曲線

組胺的線性范圍、校正曲線方程和相關系數見表1。組胺標準溶液和內標物色譜圖如圖1所示。

圖1 組胺標準溶液和內標色譜圖Fig.1 Chromatogram of histamine standard and internal

表1 組胺的線性范圍、校正曲線方程和相關系數Tab.1 The linearity of standard curve

注：表中x，y分別為組胺與內標濃度比和峰面積比.

2.1.3 回收率和精密度、方法的測定低限

在空白培養液中添加 0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、10.0 μg/mL 的組胺，按本文的實驗方法操作，所得回收率和室內精密度見表2。由表2可知，此方法的平均加標回收率為104.1%～103.8%，回收率較好。

表2 培養液中組胺回收率與精密度試驗數據Tab.2 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=6)

在空白培養液樣品中添加0.5 μg/mL的組胺標準溶液，按本文的實驗方法操作，回收率均在100%～107%之間，相對標準偏差＜15%，符合殘留分析的要求?？瞻讟悠泛图訕撕髽悠方M胺的色譜對比圖如

圖2。根據回收率試驗，本方法的測定低限為 0.5 μg/mL。

圖2 空白樣品和加標后樣品組胺的色譜對比圖Fig.2 Chromatogram of spiked histamine sample and bank sample by HPLC

2.2 溫度對產組胺菌株產組胺的影響

將產組胺菌株菌懸液接種至組胺發酵培養基中(此時菌濃度約為104CFU/mL)，分成5組(每組至少3個平行)在4℃、20℃、25℃、30℃和35℃條件下靜置培養36 h(每個溫度均設置空白對照)，測定培養液中組胺含量，結果如圖3。

從圖3可以看出，4℃時，均未檢測J2和J4產生組胺，表明此溫度下2株菌不能產生組胺，20～35℃溫度范圍內，組氨酸脫羧酶均有較強活性，且J2和J4分別在25℃和30℃時活性達到最強，檢測到組胺最大生成量分別為5.49 mg/L和12.47 mg/L，降低或升高溫度均使活性減弱。其中J2生長最適溫度與產組胺最適溫度不同，表明該菌生長最適溫度與酶作用的最適溫度不同。

2.3 pH對產組胺菌株產組胺的影響

將組胺發酵培養基pH分別調至4，5，6，7和8，然后取1 mL J2和J4菌懸液接種于裝有9 mL培養基的試管中，35℃靜置培養36 h(每個pH均設置空白對照)，測定培養液中組胺含量，結果如圖4。

由圖4可以看出，菌株J2和J4在pH=5時有最大組胺生成量9.86 mg/L和12.02 mg/L，且都隨著pH升高而降低，兩株菌在pH=4時組胺產生量少于在pH=5時，這可能與該pH下細菌總數有關。

圖3 溫度對J2和J4產組胺的影響Fig.3 Effect of the temperature on histamine production of histamine-forming bacteria

圖4 pH對菌株J2和J4產組胺的影響Fig.4 Effect of the pH on histamine production of histamine-forming bacteria

3 討論

利用高效液相色譜內標法檢測發酵液中組胺含量，發酵液前處理的方法在CHEN等[5]所用方法的基礎上稍作修改，但他們在組胺測定時，采用流動相梯度洗滌樣液，與本實驗有很大區別；本方法的回收率在101.10%左右，檢出限為0.50 μg/mL，這完全能夠滿足組胺測定需要。

菌株J2和J4均在pH=5左右有最大組胺產生量，這與RODTONG等[8]研究產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes、摩根氏菌Morganella morganii和變形桿菌Proteus vulgaris的結果類似。SANTOS[9]在較早的研究發現中就發現，細菌作為自身一個防御機制，酸性條件將有利于它們產生組氨酸脫羧酶。

4 結語

1)建立了利用高效液相色譜內標法測定細菌發酵液中組胺含量的方法，本方法組胺標準曲線相關相關系數和組胺回收率均較高且檢測限低，因此能夠滿足準確測定微量組胺含量的需要。

2)通過分離篩選從鰹魚內臟中分離得到兩株產組胺微生物J2和J4，菌株J2和J4的最適生長溫度分別為30℃和25℃，其生物量分別達到12.67 log(CFU/mL)和12.71 log(CFU/mL)；其最適pH分別為7和6，其最大生物量分別達到10.32 log(CFU/mL)和10.39 log(CFU/mL)；菌株J2和J4產組胺最適溫度分別為25℃和30℃，其組胺產生量達到5.49 mg/L和12.47 mg/L；且在最適產組胺pH=5的條件下組胺產生量分別達到9.86 mg/L和12.02 mg/L。

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[7]CHEN H C,KUNG H F,CHEN W C,et al.Determination of histamine and histamine-forming bacteria in tuna dumpling implicated in a food-borne poisoning[J].Food Chemistry,2008,106:612-618.

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