D2-40在腫瘤淋巴管標記研究應用新進展

唐 振（綜述）禹正楊（審校）

（南華大學附屬第一醫院腫瘤外科，湖南 衡陽421001）

目前惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重要疾病，然而治療惡性腫瘤的難點就是腫瘤的復發和轉移，血道及淋巴道轉移是惡性腫瘤最主要的轉移途徑和復發的根源[1]。因此惡性腫瘤的血道和淋巴道轉移與患者的預后密切相關。目前對各種腫瘤的生物學行為的研究也常涉及腫瘤淋巴管、血管生成及其與腫瘤轉移的關系。盡管早在1863年Krause等發現腫瘤內存在新生的淋巴管，但人類對淋巴系統的研究遠沒有血管系統研究的深入，造成這種現象的主要原因是缺乏有效的鑒定淋巴管的特異性的標志物[2]。由于常規HE染色中，區別淋巴管和血管非常困難，不可避免地存在主觀性，找到一種特異性和敏感性都高的淋巴管標志物，對惡性腫瘤組織中淋巴管和血管的研究顯得尤為重要。

近來區分淋巴管和血管的方法取得了積極進展，一些淋巴管內皮細胞的特異標志物被陸續發現，如酶組織化學染色5’核苷酸酶（5’Nase）、血管內皮生長因子受體-3（VEGFR-3）、淋巴管內皮透明質酸受體-1（ LYVE-1）和腎小球足突細胞黏蛋白（ Podoplanin）、D2-40等，但標記淋巴管的5’核苷酸酶以及VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin等抗體都存在許多不足之處。D2-40是新近發現的最特異性、最好的惡性腫瘤淋巴管內皮細胞標志物[3]，其特異性明顯高于目前常用的淋巴管標志物VEGFR-3等[4]。

目前對D2-40的研究是淋巴管標志物領域的一個新的研究熱點，D2-40對研究惡性腫瘤的淋巴管生成機制、淋巴管浸潤擴散以及通過靶向治療抑制腫瘤淋巴道轉移等有著積極意義。本人就D2-40在病理診斷中的應用進展作相關綜述。

D2-40的結構特征及重要生理功能：D2-40分子是Marks等[5]于1999年在研究生殖細胞腫瘤和胚胎睪丸的精母細胞表面新發現的一種唾液酸粘蛋白，其mRNA翻譯的蛋白質分子由 166個氨基酸構成，質量為43kD，是最新發現特異性標記淋巴管的鼠來源IgG1單克隆抗體。最近國外通過在人類淋巴管內皮細胞上進行Western blotting、ELISA及siRNA介導的podoplanin基因敲除等方法，發現D2-40抗體能通過唾液酸蛋白特異性結合、檢測腫瘤淋巴管內皮上固定的抗原決定簇，即跨膜糖蛋白podoplanin FC片斷，其敏感度和特異性均都高于其他淋巴管內皮的分子標志物[6]。

最新的研究發現D2-40可用來標識多種腫瘤的新生微淋巴管內皮上有固定的抗原決定簇，該抗原決定簇在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和血管內皮上沒有表達[7]。甄樂鋒[4]等用D2-40進行免疫組化染色標記組織淋巴管時發現其僅在被覆單層內皮細胞的小淋巴管如終末淋巴管顯色，它既不能使有周細胞/平滑肌的大淋巴管顯色，也不能使淋巴結內的高內皮靜脈顯色。D2-40還可在淋巴結的淋巴竇周壁細胞膜上以及淋巴管內皮細胞間隙表達[8]。超微結構研究也表明D2-40主要表達于淋巴管內皮細胞的腔面，少部分表達于非腔面和細胞間質[6]。

研究發現D2-40作為淋巴管標志物，不僅能是應用于冷凍切片，且能較好地應用于經福爾馬林處理后石蠟包埋的組織切片，其使用方法更簡便，使用范圍也更廣泛[9]。D2- 40免疫組化染色判斷淋巴管浸潤的陽性率明顯高于HE染色，并可以避免由于標本固定導致組織收縮而造成的假性淋巴管浸潤。D2-40與血管特異性標志物CD31、CD34等在惡性腫瘤中的雙重免疫組織化學染色中無交叉反應，可以用于腫瘤血管、淋巴管內皮同時染色[10-12]。

目前常見的幾種淋巴管標志物及其特點：最初采用酶組織化學染色法鑒別淋巴管和血管，5’核苷酸酶堿性磷酸酶（5’Nase-Aplases）雙重染色法。 5’-Nase染色很容易受實驗條件的影響及各種酶之間交叉反應的存在，染色后背景較深， 而且只適用于新鮮標本。最近有報道Alpase也可在淋巴管內皮細胞表達。該法在淋巴管內皮染色中的應用受到一定的限制。

VEGFR-3是第一個被發現的淋巴管內皮標志物，VEGFR-3屬于酪氨酸激酶受體家族，它也是最先發現的淋巴管特異性調控受體，主要表達于淋巴管內皮細胞的腔膜面[13]。除表達于淋巴管內皮細胞，其也表達于某些新生血管內皮，所以單獨應用VEGFR-3鑒別淋巴管和血管的特異性不高。

LYVE-1是第一個發現的對淋巴管特異的透明質酸受體，是CD44糖蛋白的同系化合物，其均勻分布于淋巴管內皮細胞的基底面和胞膜管腔面。研究表明其特異地表達于淋巴管內皮細胞，也在肝、脾竇隙狀血管和胎盤合體滋養層有表達。最近研究顯示腫瘤內約有10%的LYVE-l陽性脈管是血管[14]。

另一個淋巴管內皮特異標志物是Porx-1，其是同源異型盒轉錄因子基因產物，與胚胎淋巴管芽的生長、延伸及淋巴管內皮細胞的表型改變密切相關，是淋巴管生成過程中起調節作用。 Por-x1在內皮細胞中僅特異性地表達于淋巴管內皮細胞，但還可表達于多種類型的非內皮細胞，Prox-1尚還不能獨立標記淋巴管內皮，須與 LYVE-1等聯合使用才可確定淋巴管特異性。

腎小球足突細胞黏蛋白（podoplanin）是目前一種新的淋巴管內皮特異標志物。目前除了在皮膚某些血管內皮發現其表達外，尚未見其表達于其他組織微血管的報道。雖然podoplanin非常廣泛地用作淋巴內皮細胞和淋巴管生成的特異性標志物，但是與D2-40比較，后者有如下優越性：①D2-40是單克隆抗體，而podoplanin 是多克隆抗體；②D2-40不需要特殊處理，可以直接使用，而podoplanin需要作前期親和力純化而使用硝基纖維素分解封閉重組體蛋白; ③在進行免疫組化過程中，D2-40石蠟組織切片不需要熱修復抗原決定簇，而podoplanin需要進行熱修復。另外還有學者認為D2-40與podoplanin抗體相比，有更高的敏感性，而其特異性可高達98.8%[15]。D2-40抗體還能特異性地識別podoplanin。

D2-40在臨床病理中的應用：D2-40在許多正常細胞表面也有表達，如淋巴管內皮細胞、間皮細胞、消化道cajal細胞、肌上皮細胞、基底細胞；D2-40在某些腫瘤中也呈陽性表達，包括肌成纖維細胞瘤、胃腸道間質瘤、間皮瘤、精原細胞瘤、某些腦腫瘤（顱咽管瘤，腦脊膜瘤等）等[16]。D2-40在人乳腺、胃、結腸、黑色素瘤、前列腺的癌細胞上則沒有表達[3]。D2-40可用于識別正常組織和乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤的新生微淋巴管，檢測原發腫瘤淋巴管密度、淋巴管浸潤以及淋巴道轉移。D2-40對腫瘤診斷和鑒別診斷以及判斷惡性腫瘤轉移進展、預后具有重要意義，已開始廣泛應用于腫瘤淋巴管與腫瘤生物學行為關系的研究。

文獻報道D2-40在胃癌、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、口腔癌等腫瘤中D2-40表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度、浸潤深度、遠處器官轉移、PTNM分期密切相關，與患者性別、年齡無關。腫塊越大、有淋巴結轉移、分化程度越低、浸潤深度越深、轉移器官越多、PTNM分期越晚，淋巴管密度越大[17-18]。D2-40標記的惡性腫瘤淋巴管具有異質性，表現為不同區域的淋巴管管腔形狀大小不一和淋巴管密度不均。癌組織周邊區淋巴管數量明顯增多，淋巴管呈擴張狀不規則形，癌組織中淋巴管主要位于癌組織周邊區，淋巴管豐富，擴張與閉鎖的淋巴管并存，以擴張的為主，且管壁很薄，內皮細胞間有較寬的縫隙，而在腫瘤中心區淋巴管數量較腫瘤周圍明顯減少，淋巴管多呈閉塞條索狀。癌組織周邊的淋巴管的異?？赡芘c腫瘤具有侵襲傾向高、分化程度較差及易發生淋巴結轉移等惡性生物學特征有關。

D2-40標記淋巴管測定淋巴管密度，可以作為評估腫瘤良惡性及轉移狀況的一項輔助指標，具有良好的臨床病理應用價值，為確定臨床治療方案提供實驗和理論依據。D2-40標記的乳腺淋巴管時乳腺良性病變及乳腺癌組織均可見 D2-40的表達，但微淋巴管密度在乳腺浸潤性導管癌組明顯高于乳腺良性病變組，可能為判斷乳腺病變良惡性的指標[19]。Pearson相關性分析顯示乳腺浸潤性導管癌中微淋巴管密度與淋巴結轉移、pTNM分期呈正相關[20]，而與ER、PR 、Her-2表達無關[4]。D2-40標記的微淋巴管密度在宮頸鱗癌中的表達明顯高于正常宮頸組織及CIN組織， 且D2-40能夠比較客觀的反應早期宮頸鱗癌和癌前病變中的淋巴管新生情況[14]。Longatto-Filho[21]研究發現宮頸癌的淋巴管新生始于癌前病變。淋巴管密度也能成為判斷子宮內膜腺癌早期淋巴管轉移的一個指標[22]。保麗玲[8]等對胃癌中淋巴管密度的檢測時，經 D2-40染色證實的腫瘤淋巴管浸潤與臨床病理參數間的關系進行分析顯示，其與胃癌淋巴結轉移、Lauren分型和Ming分型密切相關。淋巴管浸潤檢測還可為早期癌癥的手術方式提供參考，即D2-40染色呈淋巴管浸潤陰性，可避免對這些患者行根治性手術[23]。此外，D2-40標記間皮細胞的特異度較高，可用于惡性間皮瘤與轉移性腺癌漿膜腔積液的鑒別[24]。D2-40還是乳腺肌上皮細胞的一個新的標志物[25]。

腫瘤細胞侵襲淋巴管形成淋巴道轉移程是一系列復雜的生物學過程，其間有多個癌基因激活、大量的細胞因子及分子通路的介導，目前的許多機制都處于探索階段。目前所知癌細胞經淋巴道轉移過程中淋巴管生成是腫瘤淋巴道轉移的重要步驟。惡性腫瘤細胞，尤其是分化較差及浸潤程度較高的惡性腫瘤細胞對周圍組織具有較強的擴散、轉移能力，容易發生淋巴道轉移。

D2-40在判斷腫瘤淋巴管分布和腫瘤轉移方面具重要作用，但在惡性腫瘤淋巴管生物學行為的研究中，我們必須認識到目前各種淋巴管標志物僅具有相對的特異性。目前對腫瘤淋巴管的認識還在不斷完善中，隨著淋巴管內皮細胞體外培養技術、轉基因技術的提高，以及微轉移檢測技術的發展，更特異、更靈敏的新生淋巴管檢測標記的發現，惡性腫瘤淋巴管生成、淋巴道轉移的機制必將得到進一步闡明，將有助于進一步了淋巴管在腫瘤生物學中的作用，并為惡性腫瘤在淋巴管生成、淋巴道轉移過程的靶向治療另辟蹊徑。

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