兔vx2聲門上喉癌動物模型的建立及雙頸部轉移淋巴結規律的觀察

張 品

（遼寧省錦州市中心醫院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121001）

聲門上型喉癌是指癌腫發生于聲帶以上部位，包括會厭癌、室帶癌、會厭室帶癌等[1]。由于聲門上區有豐富的淋巴網，因而易發生頸部淋巴結轉移。聲門上型喉癌治療失敗的主要原因是頸淋巴結的轉移及復發，也是喉癌致死的主要原因[2]。對頸部隱匿性淋巴結轉移的診

斷和治療現已成為聲門上癌治療成敗的關鍵。如何術前、術中確定頸部轉移灶，盡可能減少過度手術治療給患者造成的損傷是目前研究的熱點[3]。要想對頸淋巴轉移的診治有進一步的了解，就要對腫瘤的進展和相伴隨的淋巴轉移的特點做進一步的研究，即建立動物模型進行研究。兔VX2腫瘤廣泛應用于各種器官的腫瘤模型，其特點是腫瘤易于生長，生長速度快。本實驗主要研究出現頸淋巴轉移與時間的關系以及出現轉移的部位。及不同部位的癌腫雙頸淋巴結轉移特點。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

Vx2瘤珠，60只新西蘭大白兔。

1.2 實驗方法

1.2.1 vx2瘤的種植傳代

VX2瘤細胞株，調配1640培養液至1×107/mL活細胞濃度，取1mL瘤細胞液注射于兔后腿外側肌肉內，2周左右可形成實質性包塊，即制成傳種兔。

1.2.2 制備組織塊懸液

無菌條件下切取傳種兔后腿實體瘤，放置于盛有20ml1640液的玻璃皿中，取瘤體邊緣生長旺盛的組織，剪切成泥，離心沉淀后，加1640培養液配制成組織塊懸液20mL。

1.2.3 麻醉方法

實驗兔60只，雌雄不限，體重2.0～30.kg。每只以10%水合氯醛（5mg/kg）進行腹腔注射。

1.2.4 vx2腫瘤組織懸液接種

實驗兔以小兒支撐喉鏡暴漏會厭，上頜竇穿刺針于會厭舌面接種0.3mL瘤液。

1.3 組織病理學檢查

在接種后第1、2、3、4周分4次處死動物，（在時間觀察選擇點上，本次研究檢測第1、2、3、4周的情況，是由于既往預實驗中及參考其他類似實驗的選擇[4]）肉眼觀察喉部腫瘤生長情況，解剖雙側頸部淋巴結。行病理學檢查 。結果：①模型一般情況：種植瘤兔60只，隨機數字法分成4組，每組15只，分別在接種VX2瘤珠后，于第一、二、三、四周分4批處死動物，原位接種成功了60個。接種成功率100%。觀察結果：在第1周15只瘤兔中未出現頸內靜脈旁淋巴結轉移。在第2周15只瘤兔中有9只瘤兔出現患側頸內靜脈旁淋巴結轉移，對側頸內靜脈旁未見淋巴結轉移，第3周15只瘤兔中有9只瘤兔出現患側內靜脈旁淋巴結轉移的情況，對側頸內靜脈旁有6只出現淋巴結轉移。而在第4周14只瘤兔中患側頸內靜脈旁均出現淋巴結轉移的情況。對側有10只出現淋巴結轉移。②原發灶瘤體觀察：所有腫瘤經病理證實為V X 2 鱗狀細胞癌.

2 原發灶瘤體觀察

形態學觀察：腫瘤部位明顯隆起，表面粘膜糜爛，形成潰瘍。病理學檢查：光鏡下觀察：癌細胞排列緊密呈實體巢狀，間質結締組織少， 高倍鏡下見癌細胞大小和形態不一，胞漿豐富，淡紅染色，未見角化珠;核大而畸形，核膜清楚，核仁明顯，核分裂相多見。

3 頸部淋巴結解剖及病理學檢查

形態學觀察：淋巴結較硬，無明顯包膜，切面呈灰白色魚肉狀。

光鏡下觀察：細胞以多邊形為主。HE染色見細胞輕度嗜堿，核大，核質比例異常，細胞呈異型性明顯，可見較多核分裂象，鏡下顯示正常淋巴結結構消失，大量腫瘤細胞浸潤。

4 討 論

4.1 本次實驗瘤珠種植部位偏于一側目的在于觀察不同時間段同側淋巴結及對側淋巴結轉移出現的先后次序。本次實驗表明成瘤部位最先在患側出現淋巴結轉移，隨著瘤體的不斷生長、浸潤，對側也出現淋巴結的轉移。這也符合我們臨床上聲門上喉癌淋巴結的轉移規律，聲門上喉癌最先在同側出現淋巴結轉移，到中晚期雙側均出現淋巴結轉移。

4.2 腫瘤動物模型的建立在腫瘤研究中具有重要價值，理想的動物模型要求在發生部位、組織學類型、生物學行為等方面盡量與所對應的人類腫瘤相似。目前喉癌裸鼠動物模型研究較多，但由于所移植的腫瘤均表現為血源性轉移，所以裸鼠中移植的喉癌模型對于研究頸淋巴轉移意義不大。兔 VX2腫瘤是一種來源于 Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的鱗狀上皮細胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細胞癌。1940年建株保存 經 72次傳代培養后建立起來的仍可在兔體內種植的腫瘤細胞株。它可接種在兔的肝臟、腎臟、肌肉等處[5]。兔VX2模型具有：①其特點是性質穩定，移植成瘤率時間短，成瘤率高。②實驗成本低于細胞培養方法，操作簡單，易推廣。③嚙齒類動物頸外動脈管徑小，為動脈給藥等局部治療實驗帶來操作困難。較大的動物有其無法比擬的優勢，如取血量大等。④ Dunne[6]等專門對兔頸部淋巴結區域引流進行了系統研究，證實其與人類頸部淋巴結分布極其相似。因此兔vx2聲門上喉癌動物模型是研究腫瘤侵襲及淋巴結轉移的良好模型。

[1]黃選兆,汪吉寶.實用耳鼻咽喉科學[M].北京:人民衛生出版社,1998: 204-206.

[2]劉學忠,蕭世強.影響喉癌預后的因素[J].國外醫耳鼻咽喉科學分冊,1990,14(1):28-30.

[3]徐世影,楊蓓蓓.頭頸部鱗狀細胞癌頸部淋巴結微轉移灶的研究進展[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20(8):378–381.

[4]劉險峰,任樂榮,蘇廣彥,等.兔VX2腫瘤細胞系的建立及其生物學特性的觀察[J].中華病理學雜志,2005,34(10): 661-663.

[5]Rous P,Kidd JG,Smith WE.Experiments on the cause of rabbit Carci-noma derived from virus.induced papillomas[J].J Exp Med,1952,96(2):159-174.

[6]Dunne AA,Plehn S,Schulz S,et al.Lymph node topography of the head and neck in New Zealand White rabbits[J].Lab Anim,2003,37(1):37-43.