微生物產3-羥基丙酸研究進展

程 嫚,羅 暉,常雁紅,劉曉惠(.北京科技大學化學與生物工程學院,北京00083;.北京科技大學土木與環境工程學院,北京00083)

微生物產3-羥基丙酸研究進展

程 嫚1,2,羅 暉1,常雁紅2,劉曉惠1
(1.北京科技大學化學與生物工程學院,北京100083;2.北京科技大學土木與環境工程學院,北京100083)

介紹了3-羥基丙酸的性質、用途以及研究歷程,討論了采用誘變法和基因工程法對產3-羥基丙酸菌種進行改造的機理以及產物分離純化等方面的研究進展。

3-羥基丙酸;基因工程法;誘變法;分離純化

3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP),分子式C3H6O3,化學索引號503-66-2,為三碳無手性β-羥基羧酸,無色、無味,易溶于水、醇等有機溶劑[1]。3-HP和乳酸是同分異構體,由于羥基位置的不同,3-HP的化學性質更為活潑。3-HP是一種重要的功能性有機酸,利用已有的成熟催化技術,通過氧化、脫水、酯化反應等可以將其轉化為多種重要的化學物質,如丙烯酸、丙二酸、聚3-HP等,3-HP還可以作為食品或飼料的添加劑和防腐劑。由于3-HP應用廣泛,近年來已成為研究熱點,美國能源部也將其列為12種最具開發潛力的化工產品之一[2]。

目前,3-HP的生產方法有化學法和微生物法,化學法使用不可再生資源、副產物多、分離困難、污染嚴重,而微生物法可以有效彌補這些缺點,因此,以微生物法生產3-HP成為大勢所趨。作者在此綜述了微生物產3-HP的研究進展。

1 微生物法產3-HP的研究歷程

早在20世紀70年代,人們就發現了能夠產3-HP的野生菌株,但普遍產率低、生產周期長,應用前景非常有限。隨著基因重組技術的日益成熟,近年來人們開始研究構建基因工程菌來生產3-HP,微生物產3-HP的能力得到明顯提高,部分研究狀況見表1。

2 產3-HP菌種的選育與構建

微生物法生產3-HP的關鍵在于選育高產的菌種,現有的菌種改造方法主要有誘變法和基因工程法。其中誘變法主要是針對假絲酵母野生菌株,基因工程法主要是構建以葡萄糖或甘油為底物的重組菌株。

2.1 誘變法提高微生物產3-HP的能力

在一些自養微生物體內[6],3-HP作為一種中間代謝產物存在于某些代謝途徑中,但一般不是微生物生長所必需的物質,所以在菌體中不能大量積累,其過度積累會破壞微生物細胞內的代謝平衡。為了提高菌株的3-HP積累量,需要對菌種進行改造,誘變法就是對產3-HP野生菌株進行改造的一種常規方法。

早在1982年,Hasegawa等[5]分離出一株能夠產3-HP的皺褶假絲酵母,以亞硝基胍為誘變劑,采用以葡萄糖和丙酸分別為唯一碳源的篩選培養基,篩選不能同化丙酸的突變株,最終得到能夠高產β-羥基異丁酸和3-HP的突變體,以葡萄糖和丙酸作為碳源進行發酵,3-HP產量達到40.0 g·L-1。

近年來,國內研究者開始關注能夠產3-HP的野生菌株,主要以假絲酵母為主。朱建航等[13]分階段控制皺褶假絲酵母突變株發酵過程的p H值及糖含量等參數,3-HP的最終產量達到20.0 g·L-1。范煒煒等[9]對皺褶假絲酵母進行誘變育種,3-HP產量達到8.88 g·L-1。諸葛斌等[19]對假絲酵母進行復合誘變,在優化的培養條件下,3-HP產量達到30.0 g· L-1。

Hasegawa等[5]提出了皺褶假絲酵母體內可能存在的產3-HP的途徑,見圖1。

表1 微生物產3-HP的部分研究狀況Tab.1 Some research of 3-HP production by microorganisms

圖1 皺褶假絲酵母體內產3-HP途徑Fig.1 The pathway of producing 3-HP in Candida rugosa

2011年,Zhou等[21]根據?；鵆o A脫氫酶保守序列將皺褶假絲酵母中的丙酰Co A脫氫酶克隆出來,并在Pichia pastoris GS115中表達出重組蛋白,分析了蛋白的生化性質,部分證實了在皺褶假絲酵母中存在如圖1所示的3-HP合成途徑。

在此途徑中,為了提高3-HP的積累量,需要關注菌株的3-HP降解酶。一般認為,降解3-HP的酶為3-羥基丙酸脫氫酶。Hasegawa等[5]所篩選出來的高產3-HP的突變株,其3-羥基丙酸脫氫酶的酶活幾乎為0。Yao等[22]從蠟狀芽孢桿菌中獲得β-羥基異丁酸脫氫酶基因,并在大腸桿菌中表達,發現該酶能夠使3-HP脫氫,但是,對于皺褶假絲酵母中存在的β-羥基異丁酸脫氫酶是否也能使3-HP脫氫還需要進一步研究證實。

2.2 構建基因工程菌產3-HP

2.2.1 以葡萄糖為底物

葡萄糖是構成生物質的重要單元,開發以葡萄糖為底物的產3-HP菌株是以生物質為原料基礎的現代生物煉制技術的重要發展方向。美國卡吉爾公司在研究由葡萄糖生產3-HP方面做了大量工作,在2002年申請的專利中提出了以葡萄糖為底物產3-HP的途徑,并從不同微生物體內獲得途徑所需的酶基因,構建了基因工程菌,3-HP產量最高達到20.0 g·L-1[8]。

到目前為止,根據微生物體內的代謝途徑,學者共提出了7條由葡萄糖到3-HP的途徑[23](如圖2所示),并分析了每條途徑的能量代謝、輔酶再生等情況。由于產物的合成和輸出細胞需要ATP,并且需要達到一定的平衡,而圖2所示的各條途徑生成和消耗的ATP的量不同,因此3-HP的生成量差別很大。其中乳酸途徑的理論轉化率很高。該途徑涉及3個酶:丙酰Co A轉移酶(PCT)、乳酰Co A脫水酶(LCD)和3-羥基丙酰Co A脫水酶(OS19)。在此途徑中,由于LCD嚴格厭氧[24],所以構建的基因工程菌需要厭氧發酵。乳酸作為代謝中間產物和3-HP同時存在于發酵液中,由于它們性質相似而較難分離,因此,3-HP的 分離純化是此途徑需要解決的一個難題。

圖2 以葡萄糖為底物產3-HP的代謝途徑Fig.2 The metabolic pathways of producing 3-HP with glucose as substrate

2.2.2 以甘油為底物

21世紀初,由于生物柴油的大量生產,甘油作為一種廉價的副產物需要加以利用,因此近年來利用甘油生產3-HP的研究得到相當的重視。人們一般通過構建基因工程菌來代謝甘油產生3-HP,其主要機理是:甘油在微生物體內發生氧化還原反應,氧化反應為還原反應提供ATP和NAD+[25～27],如圖3所示。

圖3 由甘油產3-HP機理Fig.3 The mechanism of producing 3-HP from glycerol

由圖3可知,甘油產3-HP需要兩種酶:甘油脫水酶和醛脫氫酶。甘油脫水酶需要以VB12為輔酶催化甘油生成3-羥基丙醛,醛脫氫酶催化3-羥基丙醛(3-HPA)生成3-HP和NADH。甘油脫水酶在催化過程中很不穩定,是該途徑的限速酶,甘油會抑制該酶的活性,從而降低3-HP的產量,解除該抑制作用,就可以有效提高3-HP產量。權國燕等[18]構建了重組大腸桿菌,以甘油脫水酶再激活因子對甘油脫水酶進行激活,3-HP產量提高了6.4倍。王鳳寰等[28]構建了重組肺炎克雷伯桿菌轉化甘油進行3-HP和1,3-丙二醇的共發酵,不但實現了NADH的循環再生,還有效地減少了有毒中間產物3-HPA的積累,3-HP最終產量為5 g·L-1,同時產生74.5 g·L-1的1,3-丙二醇。Rathnasingh等[14]構建了以甘油為底物的重組菌,其3-HP的產量非?？捎^,達到38.7 g·L-1,但是由于酶活丟失及氧化還原反應不平衡,轉化率未能達到期望值。因此,還需要進一步研究NAD+再生系統以及提高酶活的方法。

由于構建基因工程菌涉及到多種基因,并且這些基因在宿主細胞中的穩定性、酶的活性表達以及細胞代謝流量調控等在實際生產中面臨著巨大挑戰,因此目前該技術尚未實現工業化生產,仍有許多技術問題有待解決。

3 3-HP的分離與純化

由于發酵液成分復雜,因此3-HP的分離純化是微生物法生產3-HP的一個難題,但迄今為止,其研究重點仍集中在菌株的構建與改造,很少有針對發酵液中3-HP分離的文獻報道。Meng等[29]研究了3-HP和丙烯酸等有機酸的混合物的分離并申請了專利,以乙酸乙酯或其它有機物為萃取劑,以逆流萃取的方式分離純化丙烯酸及3-HP,將萃取后的有機相蒸餾或者用水反萃取,實現了萃取劑的循環利用。Jump[30]采用電滲析方法對3-HP進行分離回收,在分離過程中將溶液中的3-羥基丙酸鈉鹽進行濃縮并轉化為3-HP,該技術還可以有效地分離溶液中的3-HP和葡萄糖,顯示了良好的應用前景。

4 結語

微生物法生產3-HP以其污染小、副產物少等特點優于化學法,而且構建的重組菌利用的是可再生資源,是未來的發展方向。但迄今為止,微生物發酵產3-HP的產量最高只有30～40 g·L-1,為了進一步提高產量,實現該方法的技術和經濟可行性,必須解決微生物法存在的一些問題,如高產物濃度耐受菌株的選育[31]、基因工程菌代謝流的調控、菌株底物轉化率的提高以及產物的高效低成本分離技術等,這也是科研人員下一步將要重點解決的問題。

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Research Progress of Producing 3-Hydroxypropionic Acid by Microorganisms

CHENG Man1,2,LUO Hui1,CHANG Yan-hong2,LIU Xiao-hui1
(1.School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083,China;2.School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China)

As a kind of important chemical intermediate,3-hydroxypropionic acid has gained more and more attention by researchers.In this paper,the properties,applications and developing process of 3-hydroxypropionic acid were introduced.The research progress of the mechanisms of the strains producing 3-hydroxypropionic acid by means of genetic engineering method and traditional mutagenesis method,and the product separation and purification were mainly reviewed.

3-hydroxypropionic acid;genetic engineering method;mutagenesis method;separation and purification

TQ 921.7 Q 819

A

1672-5425(2012)11-0009-004

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.003

2012-07-15

程嫚(1986-),女,河南蘭考人,碩士研究生,研究方向:生物化工,E-mail:chengman-123@163.com;通訊作者:羅暉,副教授,E-mail:luohui@ustb.edu.cn。