解毒化瘀法灌腸對潰瘍性結腸炎慢性期P-selectin指標的影響

劉 亞，林 燕，李興廣

(北京中醫藥大學，北京 100029)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)的病理特點是結腸黏膜及黏膜下層形成慢性炎癥和潰瘍，反復發作、遷延難愈是其病理特點，是國內外醫學界研究的重點。本課題采用緩解期解毒化瘀中藥持續灌腸治療在抗復發方面取得較好療效，通過動態觀測大鼠結腸黏膜P-selectin水平變化，探討解毒化瘀方的抗復發機理。

1 方法

1.1 材料

動物:清潔級健康 Wistar大鼠，雌雄各半，體重160g～200g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(動物合格證號 SCXK(京)2006-0009);清潔級健康新西蘭家兔，體重約2000g，由北京海淀興旺實驗動物養殖場提供(動物合格證號0003738)。試劑:三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)、弗氏完全佐劑 (Sigma公司)、P-selectin antibody(abcam)、20%福爾馬林、10%水合氯醛。藥物:解毒化瘀方(黃連、黃芩、苦參、三七粉等)(北京同仁堂藥店);奧沙拉嗪(中日友好醫院)。

1.2 方法

1.2.1 造模 采用家兔結腸黏膜-TNBS/乙醇液的免疫化學法造模。

1.2.2 分組設計與給藥 分兩個階段。將260只大鼠隨機分為4組，正常組50只，模型組50只，中藥組(解毒化瘀方)80只，西藥組80只。第一階段為急性期第1～2周(相當于UC發作期)。中藥組給予解毒化瘀方灌腸給藥，西藥組給予奧沙拉嗪灌腸給藥，正常組、模型組用潔凈水灌胃。第二階段為慢性期第3～4周(相當于 UC緩解期)。將上述急性期的中藥灌腸組隨機分為中藥持續灌腸組和中藥停藥組2組，中藥灌腸組繼續解毒化瘀方灌腸治療，中藥停藥組停止中藥灌腸;同樣，將上述急性期的西藥灌腸組也隨機分為西藥持續灌腸組和西藥停藥組2組，西藥灌腸組繼續奧沙拉嗪灌腸治療，西藥停藥組停止西藥灌腸。正常組、模型組、中藥停藥組、西藥停藥組均用潔凈水灌胃。

1.2.3 取材與處理 于造模后第1天在造模組中隨機選擇10只取材，再分別于給藥后1周末、2周末、3周末和4周末每組隨機取10只大鼠殺檢取材，進行相關指標檢測。以10%水合氯醛腹腔麻醉后剖檢，腹主動脈采血。然后截取自肛門以上8cm～12cm處病變結腸約1cm。將采集標本投入20%福爾馬林液中常溫保存72 h，將標本脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、6μm厚切片。

1.3 檢測指標 P-selectin免疫組化操作步驟:①脫蠟，水化組織切片;②3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶;③PBS沖洗，3 min×3次;④滴加一抗(P選擇素稀釋50倍)，4℃過夜;⑤PBS沖洗3 min×3次;⑥滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;⑦滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;⑧DAB溶液顯色(稀釋20倍);⑨去離子水沖洗、復染、脫水、透明和封片。NIKON顯微照相系統觀察病理改變，顯示各組組織學結構或病變特征。

2 結果

2.1 UC急慢性不同時期病理機制的異同

2.1.1 不同時間非給藥 UC大鼠 P-selectin Mean Density表達的變化 表1顯示，不同時間非給藥組UC大鼠與正常組大鼠P選擇素表達有顯著性差異(P＜0.05);隨時間推移，UC大鼠 P選擇素陽性表達依次減小，且有顯著性差異，但仍明顯高于正常組大鼠(P＜0.05)。

表1 不同時間非給藥UC大鼠P-selectin Mean Density的變化

2.2 中西藥灌腸對 P-selectin Mean Density表達的影響

2.2.1 比較慢性期中、西藥對 P-selectin Mean Density表達的調控 表2顯示，在慢性期，中西灌腸組大鼠與正常組大鼠相比P-selectin表達較高，且有極顯著差異，而在第4周末中藥灌腸組與正常組更接近;慢性期中、西藥灌腸組與模型組相比 P-selectin表達較低，且有極顯著差異;同時期中藥灌腸組與西藥灌腸組相比P-selectin表達較低，且有極顯著差異;中藥灌腸組第4周末與第3周末相比P-selectin表達較低，有極顯著差異;西藥灌腸組第4周末與第3周末相比P-selectin表達較低，有極顯著差異。

表2 比較慢性期中、西藥灌腸組P-selectin Mean Density的表達

2.3 比較緩解期中西藥持續灌腸與停藥的療效差異

2.3.1 比較緩解期中藥灌腸與中藥停藥的療效 表3顯示，在慢性期第4周末中藥灌腸組與正常組最接近，但仍有顯著差異;其他組大鼠與正常組相比，P-selectin表達較高，且有極顯著差異;慢性期中藥灌腸組和停藥組大鼠與模型組大鼠相比，P-selectin表達較低，且有極顯著差異;慢性期中藥灌腸組與中藥停藥組相比P-selectin表達較低，且有極顯著差異;中藥灌腸組第4周末與第3周末相比表達降低，有極顯著差異;中藥停藥組第4周末與第3周末相比表達降低，有顯著差異。

表3 緩解期中藥灌腸組與中藥停藥組P-selectin Mean Density表達的異同

2.3.2 比較緩解期西藥灌腸與西藥停藥的療效 表4顯示，在慢性期西藥灌腸組和停藥組大鼠與正常組相比，P-selectin表達較高，且有極顯著差異;西藥灌腸組和停藥組大鼠與模型組大鼠相比，P-selectin表達較低，且有極顯著差異;慢性期西藥灌腸組與西藥停藥組相比，P-selectin表達較低，且有極顯著差異;西藥灌腸組第4周末與第3周末相比，表達降低，有極顯著差異;西藥停藥組第4周末與第3周末相比表達降低，有顯著差異。

3 結論

資料表明，P-selectin屬黏附分子選擇素家族的組分之一，由活化血小板、內皮細胞分泌表達，并可作為這些細胞活化的標志，介導中性粒細胞和單核細胞對活化血小板和內皮細胞的黏附，是活化血小板最特異和敏感的分子標志物［1］。研究證實，UC患者血漿中 P選擇素的含量明顯高于健康人，雖然緩解期患者其含量有所下降，但仍然明顯高于正常組［2］。它在 UC發病機制中可能的作用是:①活化的血小板通過局部釋放炎癥介質、化學趨化物(如PF4、PAF)及激活其他炎癥細胞參與和增強腸黏膜炎癥過程;②血小板活化及其衍生的 TXA2易使血小板聚集阻塞腸黏膜微循環，加重腸黏膜缺氧、損傷;③血小板衍生因子從活化的血小板釋放出來，在組織損傷后的修復中起重要作用［3］。

表4 緩解期西藥灌腸組與西藥停藥組P-selectin Mean Density表達的異同

3.1 初步明確潰瘍性結腸炎發作期與緩解期的病理機制

微循環障礙貫穿UC的始終，急性期微循環障礙嚴重，慢性期微循環障礙持續存在，這種病理現象對腸黏膜屏障的修復有不利影響，可能是引起UC復發的病理機制。

3.2 闡明慢性期中西藥灌腸治療潰瘍性結腸炎各自療效優勢及保護機制

在UC慢性期，中西藥持續給藥均可改善腸黏膜的微循環狀態，改善 UC模型大鼠的一般狀況。但這時中藥組的療效更為顯著。在慢性期末，中藥灌腸組的P-selectin指標最接近正常值，可以認為在緩解期改善微循環方面中藥較西藥更有優勢。

3.3 證實緩解期中藥持續灌腸治療能夠更加有效地抗UC復發

慢性期，中西藥給藥組和停藥組均可見UC大鼠P-selectin Mean Density表達下降、一般狀況持續好轉和炎性反應繼續減少。不同的是，給藥組的總體情況較停藥組改善更迅速，其中中藥給藥組的P-selectin Mean Density最接近正常組，而西藥給藥組次之。由此可見，與緩解期(慢性期)停藥相比，在緩解期中藥持續給藥對改善UC腸黏膜微循環裝填更具優勢。

綜上所述，微循環障礙貫穿UC的始終，急性期微循環障礙嚴重，慢性期微循環障礙持續存在，這可能正是UC復發的關鍵病理機制。在緩解期，中藥與西藥相比能更加顯著地改善微循環狀態;在緩解期末，中藥持續給藥的療效已接近正常，可見緩解期中藥持續灌腸治療能夠更加有效地抗UC復發。

［1］趙亞鵬，金佩佩，周同，等.P-選擇素及其細胞黏附與血栓形成［J］.細胞生物學雜志，2007，29:22-26.

［2］楊權，陳守國，許寧.潰瘍性結腸炎患者血漿P選擇素的測定及其意義［J］.海南醫學，2004，10.8(5):322-325.

［3］Papalambros E，Sigala F，Travlou A，et al.P -selectin and antibodies against heparin-platelet factor 4 in patients w ith venous or arterial dis 2 eases after a 7-day heparin treatment［J］.J Am C oll Surg，2004 ，199(1):69-77.