p16、β-catenin、CyclinD1在宮頸病變中的表達及其臨床意義

陳海楠，楊祖菁

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院婦科，上海200092）

p16、β-catenin、CyclinD1在宮頸病變中的表達及其臨床意義

陳海楠，楊祖菁*

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院婦科，上海200092）

目的檢測p16、β-catenin和CyclinD1在正常宮頸、宮頸上皮內瘤樣病變（CIN）以及宮頸癌(CC)中的表達，研究其在宮頸病變發生發展過程中的作用及可能機制。方法應用免疫組化Envision System二步法檢測p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宮頸組織(非惡性腫瘤原因切除)、CIN和CC中的表達情況，比較三種蛋白在三組間的表達強度，并進行相關性分析。結果p16、β-catenin和CyclinD1蛋白陽性表達在正常宮頸組織、宮頸上皮CIN和CC組三組中差異具有統計學意義（P=0.00，P=0.00，P=0.00）。在正常宮頸組中三種蛋白互相之間有相關性，且呈正相關性（P=0.00，P=0.000，P=0.02）；在CIN組中，p16和β-catenin、β-catenin和CyclinD1之間有相關性，且呈正相關性（P=0.03，P=0.00），p16和CyclinD1蛋白之間有一定的相關性，差異有統計學意義(P=0.42＜0.05)；在CC組中三種蛋白互相之間有相關性，且呈正相關性（P=0.01，P=0.01，P=0.01）。結論p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在宮頸組織中異常表達可能與宮頸病變的發生和發展相關。

宮頸癌；宮頸上皮內瘤樣病變；β-連接素；細胞周期蛋白D1；p16蛋白

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年其在全球的新發病例數約50萬人，由于宮頸癌而導致死亡的人數達23萬～29萬[1]。目前宮頸癌確切的病因尚未完全明了，雖然高危型HPV感染被認為是它的主要病因[1]，但并非所有感染高危型HPV的患者都會發展為宮頸癌，這是由于人自身免疫機制的作用可以清除部分的病毒，且高危型HPV感染宮頸并導致宮頸癌的發生還需要其他因素的協同作用[2-3]。研究表明，宮頸癌的發生發展是多因素多階段演變的結果，有多種癌基因和抑癌基因的參與[2]。

隨著分子生物學技術的發展和研究的深入，人們逐漸認識到細胞周期調節紊亂可能是腫瘤發生的重要環節。因此，有關細胞周期調控的相關蛋白、調控的機制與腫瘤的發生的關系、細胞信號的轉導、相關的細胞周期檢測點逐漸成為學界研究的熱點問題。p16、β-catenin和CyclinD1蛋白作為細胞周期調節蛋白，主要作用于G1期，發揮調節作用。近年來三者在宮頸病變中的單獨作用研究較多，本文主要通過檢測p16、β-catenin和CyclinD1在正常宮頸、CIN以及宮頸癌中的表達，探討其在宮頸腫瘤的發生發展過程中的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 標本來源選取交通大學醫學院附屬新華醫院2011年8月至2012年1月初診、未治宮頸癌21例；CIN 24例；正常宮頸組織22例作為對照。CIN組和宮頸癌組的標本取自術后病變宮頸組織，正常宮頸組織則來源于因非惡性腫瘤原因（如子宮肌瘤、子宮肌腺癥等）行全子宮切除的手術的宮頸組織，全部病例組織經病理科兩位醫師診斷確診。診斷標準符合宮頸癌和宮頸上皮內瘤樣病變的病理診斷標準[4]。

1.2 方法所有標本經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚度切片，常規HE染色和免疫組化染色（采用S-P法）鼠抗人單克隆抗體p16、鼠抗人單克隆抗體cyclinD1、鼠抗人單克隆抗體β-catenin購自上海長島生物技術有限公司。嚴格按說明書操作，DAB顯色。以已知蛋白表達陽性的組織作為陽性對照。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定標準p16陽性部位為細胞核/細胞漿，β-catenin陽性部位為細胞漿/細胞核，Cyclin D1陽性部位為細胞核。免疫組化染色陽性反應為黃-棕黃顆粒。按許良中等[5]的研究，對染色結果采用雙評分法進行判定，根據陽性細胞的比例和顯色強度兩方面決定。記分標準：陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；顯色強度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者乘積≤1為陰性，1～3為弱陽性，＞3為陽性。

1.4 統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理。三種蛋白在各組的表達結果的比較采用兩等級資料比較的Mann-Whitney U秩和檢驗；三種蛋白在各組中的兩兩相關性采用Spearman等級相關分析進行統計分析。以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p16在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細胞中的表達三組中p16的陽性率分別為9.09%(2/22)、83.33%(20/24)、95.24%(20/21)。陽性表達主要集中于細胞漿（圖1、圖2）。各組間表達差異有統計學意義（P＜0.01)，見表1。

表1 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌三組中的表達(例)

圖1 CIN中p16的陽性表達(×200)圖2宮頸癌中p16的陽性表達(×200)

2.2 β-catenin在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細胞中的表達三組中β-catenin的陽性率分別為18.18%(4/22)、54.17%(13/24)、71.43%(15/21)。CIN組陽性表達主要集中于細胞漿（圖3），宮頸癌組陽性表達更多見于細胞核（圖4）。各組間表達差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

2.3 CyclinD1在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細胞中的表達三組中CyclinD1的陽性率分別為13.64%(3/22)、41.67%(10/24)、80.95%(17/21)。陽性表達主要集中于細胞核（圖5、圖6）。各組間表達差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

圖3 CIN中β-catenin的陽性表達(×200)圖4宮頸癌中β-catenin的陽性表達(×200)

圖5 CIN中Cyclin D1的陽性表達(×200)圖6宮頸癌中Cyclin D1的陽性表達(×200)

2.4 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在CIN、宮頸癌三組中表達的相關性使用Spearman等級相關分析法分析CIN組中p16和β-cetenin的表達有正相關性，差異有統計學意義（r=0.440，P＜0.05）。CIN組中β-cetenin和Cyclin Dl的表達有正相關性，差異有統計學意義（r=0.625，P＜0.01）。CIN組中Cyclin Dl和p16的表達無相關性(r=0.172，P＞0.05）；宮頸癌組中p16和β-cetenin的表達有正相關性，差異有統計學意義（r=0.568，P＜0.01）。宮頸癌組中β-cetenin和Cyclin Dl的表達有正相關性，差異有統計學意義(r=0.580，P＜0.01)。宮頸癌組中Cyclin Dl和p16的表達有正相關性，差異有統計學意義（r=0.685，P=0.01）。

3 討論

細胞生長周期為G1期-S期-G2期-M期。在此細胞周期中，G1期到S期、G2期到M期被認為是關鍵點。由于G1期為控制細胞周期長短的限速期[6]，且終末分化的細胞也停留于此期，所以G1期到S期對細胞的增殖更為重要。部分細胞周期調節蛋白正是通過促進或抑制細胞通過G1期來調控細胞的增殖和分化。

β-cetenin作為一種多功能的蛋白，廣泛存在于各種類型的細胞。一方面通過與細胞膜上的鈣黏蛋白相互作用，參與細胞的粘附；另一方面作為wnt信號通路中的關鍵調控因子，參與細胞的增殖、分化和凋亡等重要的調節作用[7]。在有wnt信號時，wnt配體與低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP受體)和卷曲蛋白(Fz受體)及胞質內的蓬亂蛋白(DV1)結合后，在軸蛋白Axin的協助下，使β-catenin多聚復合體糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的活性受抑制，從而避免β-catenin的降解，使得β-catenin在細胞漿中積累，并進入細胞核，與轉錄因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結合形成二聚體，激活下游靶基因Cyclin D1等的轉錄，引起細胞增殖和分化失控導致腫瘤發生[8]。Rodríguez-Sastre等[9]將正常組織與43例癌前病變組織，126例浸潤型癌進行了免疫組化分析比較，62%癌前病變組織及70%以上的癌組織胞漿中有β-catenin的異常分布，同時在40%的癌變前組織中β-catenin胞膜表達均缺失，說明β-catenin蛋白異常表達與宮頸癌的發生具有密切關系。本研究同樣顯示β-catenin在CIN組和CC組存在較高的易位表達率，陽性率分別達到54.17%和71.43%，這可能與wnt信號轉導相關，當wnt信號不存在時，β-catenin可與細胞膜上的鈣黏蛋白結合，在胞漿內則被有效的降解，所以在正常宮頸組織中多為正常表達；當存在wnt信號時，β-catenin不易被降解，進一步向細胞漿和細胞核內聚集，表現為易位表達，說明其易位表達與宮頸病變的進展密切相關。

Cyclin D1作為G1期細胞周期素，以及wnt/ β-catenin信號通路調控的靶蛋白，在G1/S期轉換中起重要作用。在生理狀態下，細胞進入S期后CyclinD1迅速分解。如CyclinD1基因激活，則CyclinD1持續高表達，將導致G1期縮短，提前進人S期，繼而導致遺傳基因突變和染色體結構異常的細胞獲得增殖，使細胞增殖失控，最終形成腫瘤[10-11]。古麗娜·庫爾班等[12]檢測了正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的CyclinD1的表達，顯示隨宮頸病變的進展，表達強度逐級提高，證實CyclinD1的過度表達與宮頸癌的發生發展有關。本研究也提示，CyclinD1在正常宮頸組織中呈低表達，在CIN組和宮頸癌組中表達逐漸上升，且和正常組織比較差異有統計學意義。推測其可使宮頸細胞調控發生紊亂，導致細胞增生異常，對宮頸病變的發生和發展起推動作用。

本研究對wnt/β-catenin信號通路及其下游受控靶蛋白之一的CyclinD1的相關性研究顯示，兩者存在顯著的正相關性，提示wnt/β-catenin信號通路在宮頸病變的發展中起著重要作用。

編碼p16蛋白的p16基因被視為抑癌基因，在腫瘤組織中發生缺失、突變及甲基化，抑癌基因的失活也被認為在宮頸癌的發生中起重要作用。p16基因啟動子的甲基化是常見的失活形式[13]。由于p16蛋白在CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調節途徑中和CyclinD1競爭CDK4/6，且具負反饋調節作用，故而高磷酸化的pRb增多可以導致p16蛋白的高表達。Benevolo等[14]報道，使用免疫組化檢測了100例宮頸組織，提示隨宮頸病變的加劇，p16蛋白陽性率逐漸升高。Nam等[15]的研究也證實，在從CIN到宮頸癌的病變過程中，p16陽性率呈上升趨勢，差異有統計學意義。本研究也得到了同樣的結論，即p16陽性率隨宮頸病變的加重，呈上升趨勢，且差異有統計學意義。而相關性研究顯示，在CIN組中，p16和CyclinD1的相關性不明確，而在宮頸癌組中，兩者的相關性有統計學意義，也提示，隨著宮頸病變的加重，CyclinD1的陽性率進一步上升，使得高磷酸化的pRb增多，負反饋導致p16陽性率也發生明顯增加。

綜上所述，宮頸癌的發病機制復雜，絕不是單一因素導致的結局，而是一個多階段、多基因、多因素共同參與的結果。正是由于宮頸病變是個多因的、漸進的過程，這也給早期診斷和早期治療提供了更多的途徑和機會。對宮頸組織進行p16、β-catenin和CyclinD1蛋白的檢測，有助于對宮頸病變的早期診斷，同時也為宮頸癌的治療提供一種新的方向。對研究對象進行系統的隨訪研究，可進一步探討三種調節蛋白對宮頸病變預后的相關性。

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Expression of p16,β-catenin,CyclinD1 in cervical lesions and their clinical significance.

CHEN Hai-nan,YANG Zu-jing*.Department of Gynecology,Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092,CHINA

ObjectiveTo study the role of p16,β-catenin,CyclinD1 in the pathogenesis and development of cervical disease,by investigating their expression in normal cervical tissue,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical carcinoma(CC).MethodsThe expression of p16,β-catenin and cyclinD1 was tested by SPimmunohistochemistry in normal cervical tissue,CIN and CC.ResultsThe positive expression rates of p16,β-catenin and CyclinD1 showed statistically significant difference between normal cervical tissue,CIN and CC(P=0.00,P=0.00,P=0.00＜0.05). In normal cervical tissue,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.00,P=0.00, P=0.02＜0.05).In CIN,the expression between p16 and β-catenin as well as that between β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.03＜0.05,P=0.00＜0.05),while no significant correlation was found between p16 and CyclinD1(P=0.42＞0.05).In CC,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.01, P=0.01,P=0.01＜0.05).ConclusionThe abnormal expression of β-catenin,p16 and CyclinD1 may be associated with the occurrence and development of cervical lesions.

Cervical cancer;CIN;β-catenin;CyclinD1;p16 protein

R711.74

A

1003—6350（2012）22—014—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.005

2012-04-18）

陳海楠（1978—），男，上海市人，主治醫師，在讀碩士，研究方向：宮頸惡性腫瘤及內分泌。

*通訊作者：楊祖菁。E-mail:yzujing@sohu.com