綠膿桿菌分子分型方法研究進展

邢 進，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

綠膿桿菌分子分型方法研究進展

邢 進，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

綠膿桿菌是一種常見的人畜共患機會致病菌，廣泛存在于自然界，是造成實驗動物污染和醫院內感染的重要病原菌之一。分子分型方法是病原菌流行病學分析的重要手段，對于確定感染來源和途徑，檢測交叉污染和流行菌株方面非常有效。本文主要對綠膿桿菌分子分型方法的研究進展進行綜述。

綠膿桿菌;分子分型方法;動物，實驗

對病原菌的特征分析及準確分型，了解各種不同來源的菌株是否具有相同的起源，在流行病學分析中必不可少。細菌分型包括表型分型和分子分型兩種方法，對查找感染源和感染途徑、鑒別地方性菌株和流行性菌株、預防交叉感染非常重要。傳統的表型方法只靠表型不足以區別相同基因型的菌株。分子分型方法經過十多年的發展，已具備很好的穩定性和分辨力，成為了解細菌感染的流行病學特征必不可少的技術。

綠膿桿菌，又稱銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種常見的人畜共患機會致病菌，廣泛存在于自然界。該菌也是醫院內感染的重要病原菌之一［1］，在臨床上是導致囊性纖維化患者(CF)、燒傷患者和其他免疫功能低下患者院內感染的主要病原［2，3］。由于其自身的天然耐藥性以及廣譜抗生素的廣泛使用，使得多重耐藥綠膿桿菌感染的情況日益嚴重［4］。在動物中，綠膿桿菌同樣是作為一種機會致病菌存在于體內，呼吸道和腸道內均可分離得到。一般情況下并不引起動物發病，當動物免疫力低下時，才會引起動物發病，甚至死亡。

建立經濟可靠的分型系統能夠更好的對綠膿桿菌進行流行病學分析，各種分子分型方法在綠膿桿菌的流行病學研究中均有應用［5－8］，彌補了表型研究的不足。本文通過比較綠膿桿菌各種分型方法的特點，希望能夠幫助我們選擇方便、快捷、經濟和可靠的分型方法，對綠膿桿菌進行流行病學分析，設計更合理的感染控制策略。

1 以PCR為基礎的分型方法

1.1 隨機擴增多態性(random amplification of polymorphic DNA，RAPD)指紋圖譜

RAPD技術是1990年由Williams等人建立的一種分析基因多態性的分型方法［7］，是在PCR基礎上發展起來的一種分子生物學技術。RAPD-PCR通常使用的是9～10 bp的單一隨機引物，對目標基因組進行隨機擴增，隨機擴增出多條非特異性條帶，不同的菌株所得到的條帶是不同的。保持RAPD分析的可靠性和重復性，適合的退火溫度和模板DNA的質量至關重要。PCR的其他條件，如Mg2+濃度、引物濃度和模板濃度等都需要合理的優化才能得到理想的指紋圖譜［8］。在菌株遺傳背景不清楚的情況下，RAPD-PCR僅通過幾微克的模板DNA就可以對該種微生物進行分型研究。

臨床上，RAPD-PCR與血清學、形態學等方法結合，能夠很好的揭示綠膿桿菌的流行病學特征［9］。但是RAPD的缺點是由于很低的退火溫度，反應體系細微的變化就會導致RAPD-PCR圖譜結果的變化，重復性很差，而且缺乏標準化，不同實驗室之間的綠膿桿菌PAPD結果無法在統一的平臺上進行比較。由綠膿桿菌的分型結果表明，RAPD-PCR的分辨力優于RFLP和核糖體分型，但低于REP-PCR［10］。

1.2 擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)

AFLP最先由荷蘭科學家Zebean和Vos在1992年發明的檢測DNA多態性的一種方法［11］，最初用于植物基因組的研究。其基本原理是利用1～3種限制性內切酶切割目的基因組DNA，通常使用2種內切酶，一種識別高頻位點，一種識別低頻位點，EcoR I和Mse I是最常用的兩種酶。所得的擴增片段用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。若目的基因組酶切片段內的序列發生改變，或者酶切位點發生堿基突變等情況，最后的酶切片段會隨之改變，PCR擴增片段的電泳圖譜多態性也會相應變化。Pirnay等人用AFLP結合血清學、藥敏等方法，對比利時河流內的綠膿桿菌多樣性和相似性進行了研究，發現該流域具有獨特的流行株［6］。AFLP能夠很好的用于綠膿桿菌院內感染的流行病學研究，進行實時的感染暴發監測，能有效的揭示耐藥菌株的來源、感染途徑和分布特點，有助于感染的控制［12］。AFLP與其他分型方法相比，分型能力和分辨力取決于限制性內切酶和識別堿基的合理選擇。Putignani等［13］對ICU病房內患者下呼吸道綠膿桿菌分離株的基因型分析中表明AFLP與rep-PCR的分型能力相當。Naze對新生兒病房綠膿感染的研究中顯示AFLP的分型能力弱于 MLVA［7］，而在有些情況下優于 PFGE［14］。

1.3 重復序列PCR(repetitive element sequencebased PCR，rep-PCR)

rep-PCR 是1991年由 Versalovic等［15］建立的一種細菌基因組指紋分析方法，由RAPD-PCR方法發展而來，通過擴增細菌基因組中高度保守重復序列，分析基因型間的差異［16］。rep-PCR根據細菌基因組中廣泛分布的短重復序列的不同，又分為基因外重復回文序列(repetitive extragenic palindromic，REP)PCR、腸桿菌基因間重復一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)PCR和 BOX-PCR。2004年朱琴應用ERIC-PCR對56株耐亞胺培南綠膿桿菌分離株進行了聚類分析，結果將56株耐藥株分出了33 個型別［17］。Syrmis 等［18］人應用ERIC-PCR 和BOX-PCR方法對囊性纖維化患者中分離的綠膿桿菌進行了分型研究，并與PFGE方法進行了對比，結果顯示兩種rep-PCR方法的分型能力都非常理想。此外，Olive等人應用REP-PCR和ERIC-PCR方法的分型研究表明，其分辨力高于RAPD-PCR和核糖分型方法［19］。國內應用REP-PCR方法，對燒傷病房和肝移植中的綠膿桿菌分離株進行分型研究，為臨床用藥提供了依據［20－21］。Kidd等用不同方法對囊性纖維化患者(CF)中分離到的綠膿桿菌進行的分型研究表明，ERIC-PCR 的分辨力與 MLST、PFGE 相比略低［4］。BOX-PCR方法對綠膿桿菌分型的應用較少?？傊畆ep-PCR中的上述三種主要方法對于綠膿桿菌的分型，在分辨率和重復性，效果相當。與其它分型方法相比，優于RFLP、核糖體分型，比PFGE方法的分辨力略低，但相對操作簡便，經濟，可實現自動化分型，在綠膿桿菌流行病學監測中發揮重要作用。rep-PCR的主要缺點是所有的遺傳多態性在細菌基因組的特定位置，這必然會導致其在分辨力上的局限性。

1.4 多位點可變數目串聯重復序列分析(multiplelocus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA)

MLVA方法來源于微衛星的基因標記技術，是對基因組中可變數目重復序列(variable-number tandem-repeat，VNTR)的分析方法。針對每個重復序列區段涉及特異性的PCR引物，每個位點內的重復序列數目一般通過估計此位點的PCR片段大小來確定。一般細菌基因組中可用于分型的位點在20個左右，比如腸炎沙門氏菌、炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌等。

綠膿桿菌的 MLVA分型研究中，Onteniente等用綠膿桿菌PAO1株的全基因組序列為參考，建立了7個 VNTR位點的 MLVA方法［22］。Vu-Thien等人隨后建立了15個VNTR位點的MLVA方法，這種位點的組合分型更加有效、簡便和快捷。目前MLVA對綠膿桿菌分型的研究主要就是采用的這個方法，具有很好的多態性，這 15個位點分別是ms77、ms127、ms142、ms172、ms211、ms212、ms213、ms214、ms215、ms216、ms217、ms222、ms223［23－24］。而Naze等［3］人建立了僅采用其中一個位點的MLVA方法，在PCR產物的電泳處理上，不是采用普通的瓊脂糖凝膠電泳，而是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，這種方法使MLVA的分辨力提高了14%。van Mansfeld等人在Vu-Thien的研究基礎上，建立并優化了9個位點的分型方法，與PFGE和MLST兩種方法在分辨力、經濟性和便捷性的綜合比較是最佳的分型方案［25］?？傊?，MLVA方法的優點是不同綠膿桿菌的VNTR的數目能夠數字化，通過互聯網上的數據庫可以進行比對，菌株的異同一目了然。MLVA方法的關鍵是對各VNTR片段的大小進行確定，對重復序列長度太小的VNTR位點(小于15nt)，必須要進行DNA測序才能夠得出其重復序列數［27］。雖然有自動化的設備和軟件可以對這些片段大小進行分析，但是價格很高。目前，MLVA只適用于已知全基因組序列的細菌，因此其應用受到了限制。

1.5 多位點序列分析(multilocus sequencing typing，MLST)

MLST方法作為一種新的分型技術，源于多位點酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)，最初是由 Maiden MC等人在1998年建立并應用于對腦膜炎奈瑟菌的分型［26］。它是使用多個(7個以上)400～500 bp大小的管家基因位點的序列型(ST)來描述每一株細菌的不同［27］。Curran等人最先使用 7個管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE)對綠膿桿菌的 ST進行分析，證明此方法能夠很好的對綠膿桿菌臨床分離株進行分型［28－29］。Johnson等人用 MLST和 PFGE 方法對綠膿桿菌進行分型比較，結果MLST的分辨力略高于 PFGE［30］。

MLST是一種操作簡便的分子分型方法，其過程只是直接對生物樣品中的DNA片段進行PCR擴增，然后對所得到的管家基因片段進行測序［26］。測序所得到的ST結果可以在互聯網上的MLST數據庫進行對比［31］。然而MLST的不足也顯而易見，雖然其適合于菌株間的進化和相關性分析，但是對于短期內的臨床分離株分型在分辨力上存在不足，特別是與PFGE和MLVA方法的比較中證明了這一點［25］［30］。在幾種主流分型方法中，即便不算儀器設備和分析工具的成本，MLST所需費用也是最高的［25］，因此對綠膿桿菌臨床應用并不是很多。

2 以限制性酶切為基礎的分型方法

2.1 核糖體分型(ribotyping)

Ribotryping是一個基于不同細菌16S和23S rRNA的高度保守序列建立的分子分型方法［10］，通過限制性核酸內切酶對細菌基因組DNA的進行酶切，利用凝膠電泳分離不同長度的片段。再用序列標記的DNA探針對酶切片段進行雜交，該探針包含編碼高度保守16S rRNA和23S rRNA的DNA片段及間隔序列。由于一個生物的基因組中通常有多個核糖體基因，分別存在于不同長度的酶切片段中，因此核糖體分型可以得到類似指紋的結果，對細菌進行鑒定和分型。該方法可以通過選擇兩種酶的平行實驗，對一種內切酶不能識別的區域進行酶切，增加對菌株的分辨力。研究發現由于核糖體DNA限制性內切位點的變異非常慢，菌株的變異不易被檢測到，以至于核糖體分型圖譜的變化很小，可用于評價分離株之間的同源關系［32］。核糖體分型可用于對臨床綠膿桿菌耐藥菌株的相關性研究，不過與PFGE和ERIC-PCR等方法的比較研究顯示出了其分型能力和分辨力上的不足［10］。不過通過與血清分型等其它表型方法結合使用可以達到不錯的效果［33］。核糖體分型最大的優勢是實現了自動化，RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統使研究人員在一天內就可得到細菌的rDNA指紋雜交圖譜。

2.2 限制性酶切片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)

RFLP源于生物基因組DNA的自然變異，RFLP作為第一代DNA分子遺傳標記技術，極大的推動了人類DNA多態性的研究，現在已廣泛應用于用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。通過對分離出的DNA片段轉印或者其他方法分離，然后通過標記的探針對相應的基因進行檢測［19］，構建分子圖譜。RFLP就能夠檢測出堿基插入、缺失、重排或點突變所引起的差異，從而比較不同菌株間DNA水平的差異。一般常用的限制性內切酶有 Hind III，BamH I，EcoR，EcoR V，Xba I等。RFLP對靶序列的濃度和質量要求很高，低含量、不純的基因組DNA會嚴重影響RFLP分析結果。探針可以提高RFLP的分辨力，綠膿桿菌常用外毒素exoA基因探針用于分子流行病學分析［33］。由于重復性和分型能力上的不足單純的RFLP方法已經很少應用于菌株分型。有比較表明，RFLP遠不如RAPDPCR和PFGE，所以產生了PCR-RFLP技術，可以更準確的檢測綠膿桿菌流行株的基因突變情況［6］。

2.3 脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgel electrophoresis，PFGE)

PFGE是一種脈沖場凝膠電泳技術，使用相應的限制性內切酶對細菌基因組DNA上的酶切位點進行識別切割，產生若干10～800 kb的 DNA大片段，通過這些酶切片段的多態性分析菌株之間的相似性。1984年，Schwartz和Cantor報道了脈沖場電泳的方法［34］，對至少40種病原菌進行了 PFGE分型試驗，其中包括綠膿桿菌，解決了分離大片段DNA 難以分離的難題［27］。

PFGE是目前公認的用于綠膿桿菌及其他病原菌分子分型和溯源研究的“金標準”。PFGE所產生的酶切圖譜與 RAPD、MLVA、MLST、核糖體分型和RFLP等大多數分子分型方法相比是更有效的分型工具。Hector試驗了65種限制性內切酶用于對綠膿桿菌的酶切效果，結果證實SPE I是最佳的選擇。不僅所有的酶切片段大于200 kbp，而且片段數目在30條左右，數目適中。到目前為止，綠膿桿菌的PFGE分型方法已經非常成熟，從使用的酶、酶切時間、電泳條件等都得到了優化，Romling等人的研究使PFGE中DNA降解的情況得以控制，對綠膿桿菌的分型能力達到了100%［35］。1996年，美國疾病預防控制中心以PFGE技術為基礎建立了PulseNet細菌分子分型網絡，我國疾病預防控制中心(CDC)也已加入這個網絡(PulseNet China)，此網絡目前提供PFGE標準操作規程的下載，包括沙門氏菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌食源性病原菌的標準PFGE方法，用以提高對食源性疾病的快速檢測和溯源能力。實驗人員對于電泳結果的理解和分析各不相同，對結果的分析就會出現很大差異，因此 Tenover等人經過多年的研究提出了 PFGE的解釋標準［36］。作為經典的分子分型方法，PFGE已被廣泛的應用于各種細菌的流行病學研究中，適用于菌株間基因同源性的分析［30］。不過 PFGE的操作相對復雜、費時、檢測通量?。?9，37］，是制約其應用的不利因素。

3 結論

綠膿桿菌容易發生變異，很難用表型方法分辨菌株間的異同，甚至導致錯誤的結果［10－27］。分子分型方法能夠彌補表型分型的不足，理想的分型方法需要具備以下的特征:①100%的分型能力，即能夠將所有受試菌株全部分型;②高分辨能力，即將同源關系遠的菌株分開，而將同一克隆或遺傳相近的菌株聚類到一起;③良好的重復性;④操作簡便、節約時間，并且費用低。由此可見，目前還沒有完美的分型方法，每種分子分型方法包含不同分子生物學技術組成(表1)，各有優點(表2)。同時，所有的分子分型方法都存在一個很大的局限性，即不能夠對當前的流行株進行實時分析［38］。

表1 不同分型方法涉及的技術Tab.1 Techniques used in different molecular typing

表2 不同分型方法之間特點比較Tab.2 Comparison of different typing methods

總之，低成本化、自動化、標準化的分子分型方法是細菌分型研究的發展方向。隨著科學技術的發展，現有技術會不斷得到完善，同時又會有新的方法不斷涌現。分型方法是我們在微生物學、遺傳學、流行病學等一系列研究中的工具，選擇適合而合理的方法，有效監測微生物種群的分子流行病學變化，才能達到研究預期和最終目的。

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Overview of Molecular Typing Methods for Pseudomonas aeruginosa

XING Jin，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institutes for Food and Drug Control，Institute of Laboratory Animal Resources，Beijing 100050，China)

Pseudomonas aeruginosa is a common zoonotic opportunistic pathogen，widely distributed in nature，is one of important pathogens causing experimental animal pollution and intra-hospital infection.Molecular typing is an important tool in pathogen epidemiology.It is very effective for determining the source of infection and ways to detect crosscontamination and epidemic strains.In this paper，we summarized the research progress of P.aeruginosa molecular typing methods.

Pseudomonas aeruginosa;molecular typing methods;Laboratory animals

R33

A

1671-7856(2012)08-0062-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.015

2012-05-28

邢進(1979－)，男，助理研究員，研究方向:實驗動物微生物檢測。E-mail:xjvet@nifdc.org.cn。

賀爭鳴，男，研究員，E-mail:zhengminghe@163.com。