BARD1及相關蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達及意義

羅娟娟，陳 陽，張 帆

(1．皖南醫學院 法醫病理學教研室，安徽 蕪湖 241002;2．皖南醫學院附屬弋磯山醫院 病理科，安徽 蕪湖 241001)

乳腺癌現已成為女性因癌癥而死亡的最主要原因之一，BARD1是在非家族性及散發性乳腺癌患者中發現的新的抑癌基因，其在乳腺癌發生發展中的作用已成為目前研究的熱點。本研究通過免疫組織化學方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中BARD1、cerbB-2、P53、ER和 PR的表達特征，并初步探討BARD1與其他蛋白表達的相關性以及臨床病理學各因素的相關性及其臨床意義。

1 資料與方法

1．1 病例資料 收集皖南醫學院附屬弋磯山醫院病理科2009年5月～2011年5月乳腺手術切除標本，其中實驗組為156例乳腺浸潤性導管癌，對照組為22例乳腺腺病。腺病組患者年齡26～60歲，中位年齡43歲;乳腺癌組患者年齡32～76歲，中位年齡54歲;其中組織學分級Ⅰ級52例，Ⅱ級95例，Ⅲ級9例。無腋淋巴結轉移57例，有腋淋巴結轉移99例?；颊呔鶠榕?，無乳腺癌家族史，行乳腺癌根治手術，術前均未接受放療、化療及其他抗癌治療。所有標本均由兩位病理科主任醫師依據WHO 2004年乳腺及女性生殖系統分類標準診斷。

1．2 方法 上述存檔蠟塊組織均為4%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，4μm厚切片。SP兩步法免疫組織化學染色，DAB顯色。分別檢測兩組標本中BARD1、c-erbB-2、P53、ER 和 PR 蛋白的表達。兔抗人BARD1多克隆抗體(工作液)購自Novus Biologi-cals(USA)，c-erbB-2、P53、ER 和 PR 一抗及濃縮試劑盒購自武漢博士德公司。所用抗體均采用pH 6．0的檸檬酸鈉緩沖液高壓修復。以PBS代替一抗作空白對照，以已知陽性病例作陽性對照。操作嚴格按產品說明書進行。

1．3 結果判斷 免疫組織化學染色細胞膜、胞質或胞核出現清晰淡黃色至棕褐色顆粒者為陽性表達細胞。BARD1陽性表達定位于細胞核及細胞質，cerbB-2陽性表達定位于細胞膜或細胞質，P53、ER、PR陽性表達均定位于細胞核。由兩位高年資病理醫師采用雙盲法讀片，每人選擇10個具有代表性的高倍視野(×400倍)，評分后取平均值。BARD1、P53、ER、PR評分標準參考免疫組織化學染色結合染色強度和陽性細胞數進行分級［1］。染色強度評分標準:不著色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占整張切片比例評分標準:陽性細胞數 ＜5%為0分，5% ～25%為1分，＞25% ～50%為2分，＞50% ～75%為3分，＞75%為4分。2種評分乘積0分為陰性，≥1分為陽性。c-erbB-2(HER-2)采用Hercep Test進行IHC檢測分析并根據修訂的評分系統進行評分［2］。此評分系統中IHC?為HER-2陽性，IHC+及IHC－為HER-2陰性。無著色/少于10%腫瘤細胞有細胞膜著色(0/陰性);大于10%的腫瘤細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色(+/陰性);大于10%的腫瘤細胞呈現弱至中度完整的細胞膜著色(?/不確定);大于10%的腫瘤細胞呈現強的、完整的細胞膜著色(?/陽性);若兩人觀察結果相差3分則重新評定。

1．4統計學分析 計數資料采用χ2檢驗和等級相關分析，P＜0．05為有統計學意義。

2 結果

2．1 BARD1等蛋白在乳腺浸潤性導管癌和腺病中的表達 156例乳腺浸潤性導管癌及22例腺病組織中，BARD1等蛋白的表達情況見表1，其中－為失表達，+為低表達，?～?為中強度或過表達。

2．2 乳腺癌中BARD1與c-erbB-2等蛋白表達水平關聯性分析 結果顯示乳腺癌組織中BARD1的表達與 P53(P ＜0．05)表達相關，與 c-erbB-2、ER、PR表達差異無統計學意義(P值均＞0．05)。

2．3 乳腺癌中BARD1的表達與臨床病理因素的相關性 BARD1蛋白表達在不同腫瘤大小、組織學分級之間及不同臨床分期各組間差異有統計學意義(P＜0．05)，而與年齡、有無淋巴結轉移陽性率差異無統計學意義(P ＞0．05，表3)。

圖1 BARD1在乳腺癌中的表達(×400)

圖2 BARD1在腺病中的表達(×400)

表1 BARD1等蛋白在乳腺浸潤性導管癌和腺病中的表達

3 討論

BARD1是1996年在無家族性乳腺癌患者以及散發性乳腺癌患者中發現的新的乳腺癌候選抑癌基因［3］。該基因定位于2q34-35，編碼777個氨基酸殘基蛋白。BARD1不僅能與BRCA1環指區形成穩定的異二聚體，參與RNA聚合酶Ⅱ的泛素化，調節mRNA的加工過程，還可與聚腺苷酸化因子Cst FS0等相互作用。在DNA損傷修復、細胞周期、轉錄調控等多種重要通路中發揮腫瘤抑制作用［4－6］。

表2 乳腺癌中BARD1與P53、c-erbB-2等蛋白表達的關系

表3 乳腺癌中BARD1與臨床病理因素的關系

本實驗BARD1在乳腺癌組的表達明顯低于腺病組(P＜0．05)，提示抑癌基因BARD1在乳腺癌中低表達或缺失。初步分析BARD1與臨床病理指標的關系顯示BARD1表達與組織學分級、臨床分期相關，且隨腫瘤分級的升高有逐漸下降趨勢，其中Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級間的差異有統計學意義(P＜0．05)，表明BARD1蛋白的異常表達參與了乳腺癌的發生發展，與Wu等［7］報道一致。本實驗結果還顯示乳腺癌中BARD1的表達與腫瘤大小有關，而與淋巴結轉移無關，與國內外文獻報道相似。

p53基因是一個重要的抑癌管家基因，有突變型和野生型之分。國外報道p53在乳腺癌中陽性表達為27%～54%。本組156例乳腺癌p53陽性表達率為37．1%，與上述結果基本一致，且BRAD1失表達與突變型p53表達密切相關(P＜0．05)。究其原因可能與BARD1的表達上調與p53的穩定性有關［8］，并通過依賴于p53的細胞信號誘導細胞凋亡，行使抑制腫瘤的功能［9］。而 p53基因突變和BARD1的失表達共同導致BARD1無法通過p53基因發揮腫瘤抑制作用，最終促進了腫瘤的發生發展。

大量研究證實乳腺癌患者ER、PR陽性者較陰性者預后好，癌細胞分化程度高，生長緩慢，可避免不必要的內分泌器官切除［10］。本組乳腺浸潤性導管癌與乳腺腺病ER、PR表達差異不顯著，可能與標本的入選標準、標本量大小及采用的免疫組化方法等有關，156例乳腺浸潤性導管癌中，ER、PR的陽性表達率分別為45．5%、51．32%，與文獻基本一致。BARD1作為抑癌基因，可促進乳腺上皮接觸抑制，抑制BARDI基因表達后會誘導癌前病變，與ER、PR關聯分析中，未發現相關性，可能與學者推測的激素刺激腫瘤增殖的單一途徑有關，是腫瘤發生中的早期事件，而激素受體的消失則是相對較晚的事件［11］。有關學者提出的卵巢激素周期性的變化而影響其表達的程度是否相關，有待進一步研究證實。

c-erbB-2陽性率高乳腺癌患者往往病理分級較高、腫瘤分化差、生存期較短，已成為一項預后不良的生物學指標。該基因定位于17q21，參與信號傳導，細胞增殖、分化［12－13］。本組乳腺癌與腺病組織中陽性表達率差異顯著，提示c-erbB-2過度表達參與了乳腺癌的發生發展。Starita等［14］證實BRCA1-BARD1異二聚體有細胞周期調控功能。c-erbB-2作為原癌基因，其磷酸化與細胞周期調控關系密切。本實驗未發現BARD1與c-erbB-2具有相關性(P＞0．05)，提示兩種蛋白在乳腺癌組織中的表達分子生物學機制不盡相同。至于兩者在癌變過程中作用機制，筆者推斷可能是由某些致病因素(遺傳、環境、生物等)促進c-erbB-2基因過表達，產生大量促分裂因子，抑制BARD1基因表達，使細胞分裂失控，從而形成腫瘤有關。

綜上所述，研究顯示BARD1在乳腺癌中失表達率較高，提示其可作為預測乳腺癌易感性的生物指標，為乳腺癌的診斷、治療、預測預后及預防提供了很好的實驗依據。本研究沒有發現BARD1與ER、PR和c-erbB-2的相關性，不能斷然認為其無密切相關，可能與樣本量小有關，有待于進一步更深入的研究。

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