從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優化

戴佳錕，李 燕，馬 齊，關正君，張 超，張艷婷，趙榮榮，尉亞輝,*

(1.陜西省科學院酶工程研究所，陜西 西安 710600；2.陜西省酶工程技術中心，陜西 西安 710600；3.西北大學生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術省部共建重點實驗室，陜西 西安 710069；4.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優化

戴佳錕1,2,3，李 燕4，馬 齊1,2，關正君3，張 超3，張艷婷3，趙榮榮3，尉亞輝3,*

(1.陜西省科學院酶工程研究所，陜西 西安 710600；2.陜西省酶工程技術中心，陜西 西安 710600；3.西北大學生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術省部共建重點實驗室，陜西 西安 710069；4.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

建立適用于從畢赤酵母菌中提取外源重組蛋白的超聲破碎方法。采用Western Blotting免疫印記技術檢測從畢赤酵母菌中提取的外源人脂聯素蛋白活性，并以外源人脂聯素蛋白活性作為考察指標，采用單因素和L9(33)正交試驗設計，對超聲破碎條件進行優化。結果表明：在外源人脂聯素蛋白活性最高的情況下，超聲破碎條件為超聲破碎功率450W、時間25min、時間間隔(工作時間:間歇時間)10:10(s/s)，此時細胞破碎率為(67.8±2.1)%。若在超聲破碎時添加1mmol/L PMSF，雖對細胞破碎率并無顯著影響，但外源人脂聯素蛋白活性將會明顯增高。

畢赤酵母；超聲破碎法；人脂聯素蛋白；Western Blotting免疫印記技術

酵母菌已廣泛應用于食品、飼料以及發酵行業[1-4]。其不僅含有豐富的蛋白質、維生素等營養物質，而且也是基因工程技術應用中十分重要的宿主菌[5]。酵母菌所表達的外源蛋白經過糖基化、?；约疤砑佣蜴I等加工修飾后，結構和功能均與原蛋白相差無幾。但是，酵母細胞的細胞壁厚且結構復雜，主要由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質等形成的網絡結構組成[6-7]，十分不利于外源蛋白提取。因此，建立高效、實用的酵母細胞破壁方法尤為重要。

目前，雖已有多種方法應用于酵母細胞破碎，但仍存在不少弊端。例如：玻璃珠法操作復雜，液體損失大；酶裂解法成本高且易造成產物抑制；化學法作用時間長、效率低，所用試劑毒性較大[8]。而超聲破碎技術，作為一種設備需求低、使用便捷、安全性好的細胞破碎方法，現已廣泛應用于裂解原核[9-10]以及真核細胞[11]。然而，在超聲破碎法的推廣使用中，研究人員一直致力于如何提高細胞破碎率，增加外源蛋白得率，卻缺乏在提高細胞破碎率的同時，對外源蛋白損壞、降解的探索。本研究采用表達人脂聯素蛋白的重組畢赤酵母菌株做為實驗材料[12]，以保證外源蛋白高活性為首要指標，探尋適于從畢赤酵母GS115、乃至其他酵母菌株中提取外源重組蛋白的超聲破碎方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經誘導可表達人脂聯素蛋白的畢赤酵母GS115菌株(簡寫為GS115-AP)，由西北大學西部資源與現代生物技術省部共建重點實驗室構建并保存。

人脂聯素單克隆抗體(一抗) 美國ALEXIS公司；單克隆抗體IgG(二抗)、Western Blotting化學發光底物美國Pierce公司；PMSF、蝸牛酶 美國Sigma公司；PVDF雜交膜 美國Millipore公司；BMGY、BMMY液體培養基 實驗室自制；其余試劑均為國產分析純。

BMGY液體培養基：含有質量分數1%酵母浸出物、2%蛋白胨、1.34% YNB、4×10-7生物素、體積分數1%甘油、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，pH6.0；BMMY培養基：含有質量分數1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、1.34% YNB、4×10-7生物素，體積分數0.5%甲醇，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0；裂解液：50mmol/L NaH2PO4，1mmol/L EDTA-2Na，體積分數5%甘油，pH7.4。

1.2 儀器與設備

S-250D超聲破碎儀 上海生析超聲儀器有限公司；5415D低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；Western Blotting實驗設備 北京六一公司；BX50-F4顯微鏡 日本Olympus公司；GelDoc XR凝膠電泳成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養和收集

挑取GS115-AP菌株單克隆至5mL BMGY液體培養基中，于28℃、250r/min振蕩培養18h。吸取0.5mL菌液再次接種于50mL新鮮BMGY液體培養基中，同條件培養至OD600約為2.0。將菌液在6000r/min離心5min，然后收集菌體，重懸于100mL BMMY培養基中同條件下繼續培養，并且每24h向培養液中補充0.5mL甲醇。誘導表達96h后，離心收集菌體，用蒸餾水洗3遍后分成數份，每份0.5g。

1.3.2 畢赤酵母細胞的超聲破碎

將1.3.1節制備的1份酵母菌體轉入50mL離心管中，加入15mL預冷的裂解液，振蕩混勻后，冰浴20min。將超聲破碎儀探頭置于離心管液面下約1cm處，在冰浴條件下進行超聲破碎。

1.3.3 破碎率檢測

將超聲破碎前后的細胞懸液分別稀釋至適當倍數后，在顯微鏡下觀察，用細胞計數板對完整形態細胞進行計數，通過計算得到細胞破碎率，每組統計3次，取平均值。

式中：A1為破碎前的細胞計數結果；A2為破碎后的細胞計數結果。

1.3.4 外源人脂聯素蛋白質活性檢測

超聲破碎結束后，以12000r/min離心裂解懸液10min。吸取上清進行SDS-PAGE電泳，然后經轉膜、一抗(濃度1:5000)和二抗(1:2000)孵育后，在暗室中由化學發光底物顯色并用感光膠片記錄保存[13]。膠片成像后，用Quantity One凝膠成像分析軟件對條帶進行定量分析，以測得的灰度密度值數值大小直接反映外源人脂聯素蛋白活性高低(此數值只用于反映同1張圖片上各個條帶之間的強弱關系，不作為不同圖片上條帶之間對比的依據)。

2 結果與分析

2.1 破碎功率的影響

細胞懸液經冰浴處理后，分別在破碎功率1 8 0、270、360、450 、540、630W的條件下超聲破碎，破碎時間20min，時間間隔(工作時間:間歇時間)為10:8(s/s)。結果如圖1所示，破碎率隨著破碎功率的增加而相應增高，在最大功率630W時達到(72.3±1.9)%。而外源蛋白活性(以灰度密度值數值大小表示)卻與之不同。當破碎功率增加時，外源蛋白活性先是不斷升高，在450W時達到最大，而隨后開始逐漸下降。為了保證外源蛋白活性最大，將超聲破碎功率選定為450W左右較為適宜。

圖1 超聲功率對破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on breaking rate of cell walls and protein activity

2.2 破碎時間的影響

選定破碎功率450W、時間間隔10:8(s/s)，然后分別超聲破碎15、20、25、30、35、40min并檢測。結果如圖2所示，破碎率與破碎時間呈正相關，并且在25min之前破碎率增加較為顯著，之后則趨于緩慢。外源蛋白活性則隨著破碎時間的延長而不斷增加，在30min處到達峰值后便開始迅速降低。因此，選定破碎時間為30min左右較為適宜。

圖2 破碎時間對破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on breaking rate of cell walls and protein activity

2.3 破碎時間間隔的影響

在超聲破碎過程中，時間間隔是一個重要指標：時間間隔的變化直接影響著細胞破碎率，而且，時間間隔的不同還會引起超聲過程中熱效應和空化效應的改變，制約著外源蛋白活性。本試驗將破碎功率定為450W，在時間間隔分別5:10、8:10、10:10、10:8(s/s)和10:5(s/s)的條件下超聲破碎30min。從圖3可以看出，工作時間在時間間隔中所占比值越高，細胞破碎率越高。當時間間隔為10:5(s/s)時，細胞破碎率達到(91.2±2.1)%。而外源蛋白活性則先增后減，在時間間隔為10:10(s/s)時最高。因此，選定10:10(s/s)時間間隔較為適宜。

圖3 時間間隔對破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment interval on breaking rate of cell walls and protein activity

本試驗結果與李永霞等[11]研究的游離氨基酸總量在不同超聲破碎條件下變化的情況一致?？傮w上，破碎功率、破碎時間以及破碎時間間隔的變化均可歸結為破碎強度的變化。在破碎強度較低時，其適當的增加可以提高細胞破碎率，從而增加裂解懸液中蛋白質含量，最終促使外源蛋白總體活性升高。而當破碎強度達到一定程度后，雖然破碎率仍有大幅增加，但是過大的破碎強度加劇了破碎過程中的熱效應和空化效應，致使蛋白質損傷劇增，最終導致外源蛋白總體活性降低[14-15]。

2.4 超聲破碎條件的正交試驗優化

在單因素試驗基礎上，對影響外源人脂聯素蛋白活性的超聲功率、超聲時間和超聲時間間隔進行L9(33)正交試驗，因素水平見表1。在正交試驗中，以外源蛋白活性，即測得的密度灰度值作為優化指標，結果如表2所示。

表2 超聲破碎工藝優化正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal tests

從表2可知，對外源人脂聯素蛋白活性影響因素主次順序為B＞C＞A；從畢赤酵母中提取外源人脂聯素蛋白的最佳工藝條件為A2B1C2，即超聲功率450W、超聲時間25min、超聲時間間隔10:10(s/s)。由表3可知，超聲時間是影響外源人脂聯素蛋白活性的顯著性因素。

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

2.5 PMSF對外源蛋白活性的影響

PMSF是一種廣泛使用的蛋白酶抑制劑，可以有效抑制蛋白水解酶和巰基蛋白酶活性，從而減少外源蛋白的降解和損傷。將獲得的菌體重懸于15mL預冷的裂解液中，冰浴20min，然后加入PMSF使之終濃度達到1mmol/L?？瞻捉M與實驗組均在破碎功率450W、時間間隔10:10(s/s)的條件下超聲破碎25min。結果如圖4所示，PMSF添加組與空白組的細胞破碎率并無顯著差異，分別為(67.1±2.5)%和(67.8±2.1)%。然而，PMSF添加組的外源蛋白活性卻明顯高于空白組。這說明在細胞超聲破碎過程中，PMSF僅僅具有蛋白酶抑制劑的作用，其可以對外源蛋白起到較好的保護，但對細胞破碎率卻無輔助功效。

圖 4 PMSF對破碎率及外源蛋白活性的影響Fig.4 Effect of PMSF addition on breaking rate of cell walls and protein activity

2.6 超聲破碎法與玻璃珠法和酶裂解法的對比

用優化后的超聲破碎法與玻璃珠法[13]和酶裂解法[16]分別處理酵母細胞，將細胞破碎率進行對比，結果見表4。從表4可以看出，超聲破碎法和玻璃珠法的破碎率近似，均優于酶裂解法。

表4 不同破碎方法所得的細胞破碎率Table 4 Breaking rate of cell walls by using different methods

3 結 論

超聲破碎法技術成熟，已廣泛應用于破碎各種細胞。以往的研究大多著重于追求高破碎率以獲得盡可能多的外源蛋白，卻忽略了外源蛋白活性的高低。本實驗將外源蛋白活性作為首要指標，探尋在外源蛋白活性最高時的超聲破碎條件。由畢赤酵母GS115細胞的超聲破碎結果可以得出，在破碎功率450W、時間間隔10:10(s/s)條件下破碎25min時，外源人脂聯素蛋白所受損傷最小，活性最高。

在裂解液中添加適量的PMSF(1mmol/L)可以有效地提高外源蛋白質活性，但對細胞破碎率幾乎無影響，PMSF添加與未添加組的細胞破碎率分別為(67.1±2.5)%和(67.8±2.1)%。

優化得到的超聲破碎法與傳統的玻璃珠法和酶裂解法相比，操作簡便、成本低廉。在推廣使用中，只需在本實驗結果的基礎上進行少許調整和改進，便可廣泛應用于破碎其他酵母細胞或提取不同種類的外源蛋白。

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Optimization of Ultrasonic Treatment for Recovery of Recombinant Protein fromPichia pastoris

DAI Jia-kun1,2,3，LI Yan4，MA Qi1,2，GUAN Zheng-jun3，ZHANG Chao3，ZHANG Yan-ting3，ZHAO Rong-rong3，WEI Ya-hui3,*
(1. Institute of Enzyme Engineering, Shaanxi Academy of Sciences, Xi，an 710600, China；2. Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi, Xi，an 710600, China；3. Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, College of Life Science, Northwest University, Xi，an 710069, China；4. Shaanxi Provincial Institute of Microbiology, Xi，an 710043, China)

In order to establish an appropriate ultrasonic treatment method for the recovery of recombinant protein fromPichia pastoris, the activity of human-adiponectin recombinant protein was evaluated by Western Blotting analysis. A L9(33) orthogonal array design based on single-factor tests was employed to optimize the conditions for ultrasonic treatment. The results showed that the optimal ultrasonic treatment conditions were ultrasonic power of 450 W, ultrasonic treatment time of 25 min and ultrasonic treatment interval of 10 s. Under the optimal ultrasonic treatment conditions, the breaking rate of cell walls was (67.8 ± 2.1)%.The activity of human-adiponectin recombinant protein could be significantly improved by adding 1 mmol/L of PMSF although the addition of PMSF had no effect on breaking rate of cell walls.

Pichia pastoris；ultrasonication；human-adiponectin protein；Western Blotting analysis

Q819

A

1002-6630(2012)10-0057-04

2011-05-18

陜西省科學院科技計劃項目(2011K-17)；西北大學自主創新類項目(10YZZ36)

戴佳錕(1984—)，男，初級研究員，碩士，研究方向為基因工程及細胞工程制藥。E-mail：djkxa@163.com

*通信作者：尉亞輝(1960—)，男，教授，博士，研究方向為基因工程及細胞工程制藥。E-mail：weiyahui@nwu.edu.cn