轉化生長因子-β1在多柔比星致大鼠心肌細胞凋亡中的促進作用

陳星，潘建業，周艷芳，王好，顧琳，張國輝

(江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002)

蒽環類藥物多柔比星(doxorubicin，DOX)作為化療藥物已廣泛應用于腫瘤的治療，但同時也會引起人體嚴重的并發癥，其中以心臟毒性最具代表性，臨床上主要表現為心肌病的慢性發展，最終可導致心力衰竭［1］，這一過程被認為是多因素共同作用的結果，主要包括活性氧自由基增多、脂質過氧化、鈣超載、細胞凋亡、能量代謝紊亂等［2］。在心衰的發展過程中有多種細胞因子參與調控，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為多效性細胞因子，能夠抑制炎癥、促進血管新生，但同時也會引起心肌細胞肥大、凋亡及纖維化等［3］。本研究觀察不同濃度多柔比星作用于大鼠心肌細胞不同時間后，心肌細胞的存活率和凋亡率的改變以及TGF-β1表達量的差異，探討 TGF-β1在多柔比星心臟損傷過程中是否具有促進作用。

1 材料和方法

1.1 動物和主要試劑

新生SD大鼠，1～2日齡，雌雄不限，由江蘇大學動物實驗中心提供。

鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司，DMEM-F12培養基購自美國Gibco公司，標準小牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司，多聚賴氨酸購自碧云天生物科技公司，α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomericactin，α-SA)、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，噻唑藍(MTT)、AnnexinⅤ/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，TGF-β1ELISA試劑盒購自R＆D公司。其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞分離及培養 新生SD大鼠經75%乙醇消毒2次，無菌條件下取出心臟，將其剪成1 mm左右的組織塊，用PBS清洗組織塊2遍。用0.06%胰酶和0.1%Ⅰ型膠原酶共同消化，收集消化后的上清并用含20%血清的DMEM-F12中和，直到組織塊變透明終止消化。將收集的細胞離心、重懸，差速貼壁1.5 h，后將純化的心肌細胞按所需密度接種于不同的細胞培養板中，置于37℃、5%CO2培養箱培養。24 h后用含10%小牛血清的DMEM-F12更換培養液。

1.2.2 心肌細胞形態學觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察培養1～3 d的心肌細胞形態及搏動情況。取培養3 d的心肌細胞進行α-SA鑒定，α-SA陽性率作為心肌細胞純度鑒定的指標。400倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數20～30個細胞，計算α-SA陽性細胞比例。

1.2.3 MTT法檢測心肌細胞存活率 心肌細胞按密度1×105/ml接種于96孔板培養3 d，分別加入終濃度為 0.5，1，2 μmol/L 的多柔比星，各濃度組又分4，12，24，48，72 h 時間點進行檢測，以不加多柔比星培養的心肌細胞作為對照組，每組設3個復孔。以空白孔調零。各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，37℃孵育4 h后，吸出每孔上清，再各加入200 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解，酶標儀(490 nm)檢測各孔光密度(D)值。心肌細胞存活率=(多柔比星組D值-空白孔D值)/(對照組D值-空白孔D值)×100%。

1.2.4 流式細胞術AnnexinⅤ/PI雙染法檢測凋亡率 心肌細胞按密度1×106/ml培養，分為對照組和多柔比星組，多柔比星組以2 μmol/L多柔比星處理心肌細胞，4，12，24，48，72 h 后進行檢測。接種于培養板中的各組細胞加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞2次;各組分別加入結合緩沖液(binding buffer)500 μl混勻懸浮細胞，加入 5 μl FITC標記的膜結合蛋白V(Annexin V-FITC)避光反應，再加入10 μl碘化丙啶(PI)避光4℃孵育5 min，流式細胞儀檢測分析。以AnnexinⅤ(+)/PI(-)、AnnexinⅤ(+)/PI(+)兩個象限的細胞比例之和作為凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測各組心肌細胞上清中 TGF-β1含量 心肌細胞按3×105/ml接種24孔板培養。收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒操作，酶標儀(450 nm)檢測各孔光密度值，根據標準曲線計算各組細胞上清中TGF-β1濃度。

1.3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(±s)表示，重復測量資料采用一般線性模型方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，相關分析采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳鼠心肌細胞形態學觀察

原代分離及純化后的心肌細胞，培養1 d能夠貼壁，一部分細胞有微弱的自發搏動，頻率為30～40次/min;培養2 d的心肌細胞逐漸伸出偽足，由圓形變為梭形;培養3 d的心肌細胞呈星形、三角形及不規則形，呈團簇狀生長，匯合后出現同步搏動，頻率為50～60次/min。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養乳鼠心肌細胞形態學改變(×400)Fig 1 The cultured cardiomyocytes isolated from 1～2 d SD rats(×400)

2.2 心肌細胞的純度鑒定

培養3 d的心肌細胞α-SA鑒定，心肌細胞胞質內呈棕黃色，即表達為陽性，非心肌細胞胞質內表達陰性，結果顯示心肌細胞純度可達90%。見圖2。

圖2 α-SA免疫化學染色鑒定原代心肌細胞純度(×400)Fig 2 The purify of cardiomyocytes was evaluated by immunocytochemical staining with α-SA(×400)

2.3 多柔比星不同濃度及不同處理時間對心肌細胞存活率的影響

在每個時間點，不同濃度多柔比星處理后的心肌細胞與對照組相比，隨著多柔比星濃度的增加，心肌細胞存活率隨之下降，呈劑量依賴性(P＜0.05);其中，2 μmol/L 組較0.5 μmol/L 組和1 μmol/L 組心肌細胞存活率顯著下降(P＜0.01)。同一濃度不同時間點之間兩兩比較，除0.5 μmol/L濃度組48 h和72 h間心肌細胞存活率差異無統計學意義(P＞0.05)，其余各組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 多柔比星不同濃度及不同處理時間對心肌細胞存活率的影響(±s，n=3)Fig 3 The survival rates of cardiomyocytes induced by different concertrations and different times of DOX

2.4 多柔比星對心肌細胞凋亡的影響

流式細胞術分析表明，對照組心肌細胞凋亡率為(1.39 ±0.18)%，而2 μmol/L 多柔比星誘導心肌細胞4 h后，其凋亡率為(3.65±0.49)%，較對照組增加(P＜0.05);隨著處理時間延長，心肌細胞凋亡率逐漸增加，12，24，48，72 h 的凋亡率分別為(8.54±0.64)%，(11.70 ±1.62)%，(17.67 ±1.48)%，(17.80 ±1.67)%，呈時間依賴性(F=103.80，P ＜0.05)，其中，48 h組和72 h組之間凋亡率差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖4。

2.5 多柔比星對心肌細胞分泌TGF-β1的影響

2 μmol/L多柔比星處理心肌細胞不同時間后，12 h、24 h、48 h 細胞上清中 TGF-β1蛋白濃度較對照組明顯增加，72 h 較 24 h，48 h TGF-β1分泌量下降(P＜0.05)，見圖 5。同時，多柔比星誘導 4～48 h后，其所分泌的TGF-β1與心肌細胞凋亡率呈正相關，r=0.932。

3 討論

蒽環類抗生素多柔比星作為化療藥物已廣泛用于治療各種腫瘤疾病。然而研究發現，多柔比星治療的腫瘤患者，其心臟疾病發生率呈劑量依賴性，當累積藥量達到550 mg/m2時，心臟疾病發生率可達7%［4］。多柔比星心臟毒性臨床上主要表現為慢性心肌病過程，嚴重者可發展為伴有充血性心力衰竭的擴張型心肌?。?］。研究者們希望在不降低多柔比星抗腫瘤特性的同時，減少心臟毒性的發生。目前，對于多柔比星心臟毒性的機制仍不明確，普遍認為，活性氧自由基(ROS)生成、脂質過氧化、線粒體損傷、鈣超載、Fe2+-DOX復合物引起的氧化應激是其中重要環節。隨著研究深入，多柔比星導致心肌細胞凋亡、細胞因子及特異性基因異常表達、代謝產物阿霉素醇(DOXol)異常蓄積逐漸成為新的研究熱點［2］。

圖4 流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡率Fig 4 The apoptosis rate was determined by flow cytometry(FCM)

圖5 多柔比星誘導心肌細胞不同時間TGF-β1蛋白表達量Fig 5 The protein levels of TGF-β1of cardiomyocytes treated by 2 μmol/L DOX with different times

多柔比星引起的心肌細胞凋亡是心肌病呈慢性發展，并且最終導致心力衰竭的關鍵。心肌細胞線粒體損傷是多柔比星誘導心肌細胞凋亡的前兆，表現為線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化，并能釋放一系列可溶性促凋亡蛋白進入細胞質，如細胞色素C、AIF、Smac等，這一機制本課題組已有前期研究［5］。研究還發現，除內在線粒體介導凋亡，多柔比星可以通過激活p38 MAPK途徑誘導細胞凋亡，這可能與氧化應激導致ROS蓄積有關［6］。同時，p38 MAPK信號通路又能調節各種促凋亡細胞因子表達，包括TNF-α、IL-1β、TGF-β 等［7］。

然而，多柔比星是否可以通過誘導心肌細胞自身分泌TGF-β來誘導凋亡尚未見報道。在心衰發展過程中，心臟由代償轉向失代償，心肌細胞或非心肌細胞自身都能產生一系列細胞因子，通過自分泌或旁分泌，在特定的條件下，經特定的信號級聯通路，調控心衰的發生發展。研究發現，TGF-β是在心力衰竭過程中急劇增加的細胞因子中的一員［8］。TGF-β1作為TGF-β超家族中的重要亞型，生物學功能最復雜，對其研究也最多［3］。TGF-β1在介導心肌細胞凋亡過程中，主要依賴 SMAD信號通路［9］。Schr?der等［10］發現 AngⅡ通過 p38 MAPK 通路激活GATA和AP-1(轉錄激活因子)，使大鼠心肌細胞TGF-β1表達上調，而分泌的 TGF-β1又可以作用于心肌細胞自身，通過激活SMAD信號通路誘導心肌細胞凋亡;Heger等［11］發現 TGF-β1可激活 SMAD4 蛋白，SMAD4又可誘發心肌細胞由肥大向凋亡轉變。在大鼠心肌梗死模型中，內皮氧化亞氮合酶(eNOS)能下調Caspase-3、TGF-β1蛋白水平，而在eNOS抑制劑LNAME的作用下，其抑制心肌細胞凋亡的作用減弱，這與抑制 TGF-β1/Smad2信號轉導有關［12］。研究者們還發現在擴張型心肌病患者心肌組織中TGF-β1表達上調，且其表達量高低與患者預后密切相關［13］。

本實驗通過體外培養原代乳鼠心肌細胞，發現多柔比星在0.5～2 μmol/L濃度范圍內均可使心肌細胞存活率下降，呈濃度依賴性，且2 μmol/L多柔比星可使細胞存活率顯著下降;多柔比星誘導心肌細胞4～72 h，細胞存活率呈時間依賴性下降，且4 h即可出現顯著下降。

在成功建立多柔比星體外心肌細胞損傷模型的基礎上，用2 μmol/L多柔比星誘導心肌細胞不同時間，4～48 h內可使細胞凋亡率隨時間延長而顯著增加，同時細胞自身能夠不斷分泌TGF-β1且分泌量不斷增加，與細胞凋亡率呈正相關，而72 h后TGF-β1分泌量逐漸下降，我們推測這可能與大量心肌細胞出現凋亡及部分壞死后正常分泌功能受損，以及TGF-β1分泌后降解以致檢測濃度下降有關。

綜上所述，采用2 μmol/L多柔比星誘導心肌細胞4 h即可建立體外心肌細胞損傷模型，在誘導凋亡的同時，心肌細胞TGF-β1表達量逐漸增加，與細胞凋亡率呈正相關，提示在多柔比星誘導心肌細胞時，可以通過自分泌TGF-β1促使心肌細胞發生凋亡，這可能是多柔比星心臟毒性引起心力衰竭的重要機制之一。

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