N-乙酰半胱氨酸對脂多糖刺激仔豬腸道損傷的緩解作用

李 嬌 伍國華 侯永清 王 蕾 丁斌鷹 朱惠玲 劉玉蘭

(武漢工業學院動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023)

腸黏膜是營養物質消化和吸收的重要場所，同時也是防御腸道內微生物及致炎因子入侵的主要門戶,維護腸黏膜的健康具有重要意義。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要致病成分，能誘導宿主細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)和活性氧族(ROS)等特異性致炎細胞因子,導致炎癥的發生[1]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)為硫醇類化合物、巰基供給劑，在試驗中及臨床上都已得到廣泛的應用[2]。NAC具有多種藥理作用，它可以調節機體細胞凋亡程序，減少炎性細胞因子產生，清除自由基。研究表明，NAC可減輕輻射損傷相關腸屏障功能障礙(腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加和內毒素異位等)[3]。還有研究發現，NAC能降低門靜脈內毒素水平，改善梗阻性黃疸大鼠腸道屏障功能，有效減輕腸道黏膜的損傷[4]。但目前有關NAC的應用研究主要集中在醫學領域或試驗動物上，在動物科學領域的研究與應用報道很少。本試驗采用脂多糖(LPS)刺激仔豬建立腸道受損模型，研究NAC對LPS刺激導致的腸道損傷是否具有緩解作用，為NAC的應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

N-乙酰半胱氨酸(NAC，市售醫藥級產品，純度≥99.0%)、大腸桿菌脂多糖（LPS，大腸桿菌血清型055:B5，Sigma公司產品）。

1.2 試驗動物與設計

選取24頭來源一致健康仔豬 [杜洛克×長白×大白，體重（7.63±0.15）kg]，按單因子設計隨機分配到4個處理組：①空白對照組、②LPS組、③0.025%NAC組、④0.05%NAC組。每個處理6個重復，每個重復1頭豬。處理①和②組飼喂基礎日糧，處理③和④組在基礎日糧的基礎上分別添加0.025%NAC和0.05%NAC。試驗期為17 d。試驗第17 d處理②、③、④組仔豬按照100 μg/kg BW的劑量腹膜注射LPS，處理①組注射等量的生理鹽水。注射LPS或生理鹽水6 h后，仔豬注射50 mg/kg BW戊巴比妥鈉，待完全麻醉后屠宰。

1.3 試驗日糧

基礎日糧配制參照NRC（1998）豬的營養需要（8～20 kg），日糧的組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平（風干基礎）

1.4 飼養管理

試驗期間豬舍溫度保持在22～25℃。在不銹鋼代謝籠中飼養試驗豬，鴨嘴式飲水器自動供水，自由采食，豬舍定期清掃和消毒。

1.5 腸道樣品采集及處理

仔豬屠宰后剖開腹腔取十二指腸、空腸和回腸，將三段腸從其腸系膜處取下并立即置于冰上。十二指腸是取胃和膽管在小腸開口處之間的部分，組織取樣距胃賁門5 cm處；空腸是十二指腸和回腸間的部分，于空腸的1/2處取樣；回腸是回盲瓣和結腸間的部分，于回腸的1/2處取樣，所取腸段均為10 cm左右。用剪刀輕輕剖開腸段，并用冷凍生理鹽水輕輕沖洗腸壁內容物，用濾紙吸干水分，而后用載玻片刮取腸黏膜[5]，分裝在無菌的凍存管中，并立即在液氮中冷凍，再轉移至-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 小腸黏膜蛋白（TP）、DNA和RNA的含量

腸黏膜勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，再稀釋到濃度為1%，蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[6]。DNA濃度用紫外可見分光光度法[7]測定。RNA濃度通過測定232 nm和260 nm處的吸光度值，用F1eck-Begg[8]公式算出。 DNA、RNA和蛋白質濃度分別乘以黏膜重量即為DNA、RNA和蛋白質在腸黏膜中的總量。

1.6.2 小腸黏膜二糖酶活性

十二指腸、空腸和回腸黏膜稱重后，用冰凍的生理鹽水稀釋（10∶1，v/w），再用勻漿器冰上勻漿，14 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶偶聯法（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶偶聯法）測定[9]。

酶活力單位定義：37℃下每分鐘分解1.0 μmol/l底物為1個酶活力單位，單位為μmol底物/min或U。

二糖酶活力＝X×n/60×a

式中：X——反式所釋放的葡萄糖（μmol/l）；

a——二糖中葡萄糖釋放量，麥芽糖為2，蔗糖和乳糖為1；

n——樣品稀釋倍數；

60——反應時間（min）。

1.6.3 空腸黏膜occludin蛋白相對表達量

采用Western blot方法測定。取約0.1 g空腸黏膜,加入0.5～1 ml冷Lysis Buffer(凱基全蛋白提取試劑盒),勻漿，在 12 000 ×g、4 ℃下離心 15 min,上清液即為全蛋白提取物。然后用考馬斯亮藍染色法測量吸光度,求出總蛋白濃度,根據此濃度配成等蛋白濃度溶液。用2×SDS上樣緩沖液按1∶1稀釋待測蛋白樣品,于100℃煮沸5 min,然后垂直電泳分離。分離膠濃度10%,電泳結束后,半干法轉膜至PVDF膜上,室溫5%脫脂奶粉封閉1 h,洗膜后孵occludin(Invitrogen公司)和β-actin,4℃過夜,洗膜后孵二抗,室溫下孵育1.5 h。再次洗膜后用ECL發光試劑（Pierce公司）顯影，用Alpha Innotech成像系統軟件分析occludin蛋白相對表達量,結果以occludin蛋白與內參的灰度比值表示。

1.7 數據分析

試驗數據采用 SPSS 13.0統計軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's法多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 NAC對LPS刺激仔豬小腸黏膜細胞生長的影響

小腸各段DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值結果見表2。

表2 NAC對LPS刺激仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值的影響

由表2可知，與空白的對照組相比，LPS組空腸黏膜的DNA含量顯著下降（P＜0.05）；空腸黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均顯著提高（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組空腸黏膜的DNA含量顯著提高（P＜0.05），RNA/DNA 比值顯著降低（P＜0.05）；0.05%NAC組空腸黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均顯著降低（P＜0.05）。其他各項檢測指標差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 NAC對LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響（見表 3）

表3 NAC對LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響（U/mg prot.）（n=6）

由表3可知，與空白對照組相比，LPS組空腸麥芽糖酶、十二指腸和空腸乳糖酶活性顯著下降（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組十二指腸乳糖酶活性顯著提高（P＜0.05）；0.05%NAC組空腸麥芽糖酶、十二指腸和空腸乳糖酶活性均顯著提高（P＜0.05）。其他指標差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 NAC對LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對表達量的影響（見圖1）

圖1 NAC對LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對表達量的影響

由圖1可知，與空白對照組相比，LPS組空腸黏膜occludin相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組和0.05%NAC組空腸黏膜occludin相對表達量顯著提高（P＜0.05）。

3 討論

3.1 添加NAC對LPS刺激仔豬小腸黏膜細胞生長的影響

腸黏膜細胞生長的本質是細胞數目的增加和細胞體積的增大。DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值可以作為腸黏膜細胞生長發育的生化指標。DNA含量是細胞數量增加的指標，RNA含量的增大通常意味著蛋白質合成的增加。RNA/DNA比值能比較準確反映細胞大小增加的情況[10]。TP/DNA比值可作為衡量細胞肥大程度的指標，反映細胞的大小[11]。

LPS刺激能降低空腸黏膜DNA含量，這與張偉[12]的研究結果類似。而添加NAC后DNA含量明顯提高，這說明NAC對LPS刺激導致的腸黏膜細胞數量減少有緩解作用，進而對腸黏膜產生了保護作用。其作用機制可能是抑制過氧化物造成的DNA斷裂和化學誘導的細胞轉化，增強DNA甲基轉移酶活性，修復受損的DNA[13]。NAC的這種修復作用可以保護細胞免于DNA損傷引起的死亡[14]。試驗結果還發現，LPS刺激后，導致空腸黏膜RNA/DNA、TP/DNA比值提高，NAC能使比值降低，這可能是因為處于應激狀態下，腸黏膜細胞在受損時，表現為細胞的活性增強，病理性腫脹，單個細胞的生長效率加快，代償性代謝旺盛，負荷過重所致，添加NAC能較好地緩解這種病理性變化。

3.2 添加NAC對LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響

在動物體內，碳水化合物消化吸收的關鍵酶是小腸二糖酶。二糖酶是小腸絨毛刷狀緣上的主要蛋白質[15]，小腸黏膜上皮細胞的數量始終處于一個動態變化的過程中，二糖酶就是來自脫落的腸黏膜上皮細胞，細胞脫落崩解后釋放二糖酶。二糖酶活性大小可衡量腸道黏膜上皮細胞發育程度和功能強弱[16]。多糖和寡糖需先在消化酶的作用下形成二糖，再經二糖酶分解成單糖后才能被吸收[17]。本試驗結果表明，日糧中添加NAC對LPS刺激導致十二指腸乳糖酶、空腸麥芽糖酶和乳糖酶活性的降低有一定的緩解作用。研究表明，LPS刺激宿主細胞表達活性氧族（ROS）等細胞因子，ROS作為NADPH氧化酶產生的第二信使參與炎癥反應[18]。NAC可以抑制細胞中NADPH氧化酶活性，進而抑制LPS刺激細胞因子（TNF-α和ROS）的表達，阻斷LPS的作用通路，從而使小腸黏膜細胞不斷更新，二糖酶的分泌釋放恢復正常。

3.3 添加NAC對LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對表達量的影響

內毒素通過腸黏膜的主要途徑是經腸黏膜細胞間緊密連接直接透過細胞膜，而位于腸上皮的緊密連接對維持腸黏膜的屏障功能至關重要[19]，occludin是細胞間緊密連接的特征性蛋白，可以直接反映緊密連接的結構和功能的完整性。有研究發現，occludin蛋白對維持腸黏膜屏障功能起至關重要的作用，其表達可改變腸黏膜通透性[20]。體外研究試驗證實，TNF-α能降解緊密連接蛋白[21-22]，抑制occludin的表達[23]，增加腸道上皮細胞的通透性。

在本試驗中，日糧中添加NAC緩解了LPS刺激導致的空腸黏膜細胞間occludin表達下降，這與本實驗室前期研究結果一致[24]，說明NAC可能通過抑制LPS引起的細胞因子TNF-α的表達，促進occludin的表達，進而修復細胞間緊密連接，改善腸道屏障功能、緩解腸道損傷。

4 結論

LPS刺激損傷仔豬腸道黏膜，導致DNA含量減少、二糖酶活性降低和occludin表達量降低，日糧中添加0.025%或0.05%NAC對LPS刺激所導致的腸道損傷有緩解作用。