白木通籽分離蛋白的理化與功能性質研究

史 卿，杜研學，趙 強，阮 霞，熊 華，鐘紅蘭，白春清，黃聲芳

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047)

白木通(Akebia trifoliate(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd)屬于木通科木通屬植物，據《中國藥典》2005版一部記載，其干燥莖藤入藥可作木通用，味苦，性寒，具利尿、活血通脈、抗菌消炎之功效［1］。白木通果肉呈乳白色，含豐富的淀粉和可溶性糖，味美可食，果肉中含17種氨基酸，蛋白質總量為0.98g/100g，維生素 C含量高達84mg/100g，另外還含豐富的鈣、鈉、鋅、鎂、鉀等礦質元素［2］，其果肉的營養成分結構與沙棘大體相當。據醫學研究表明，白木通莖藤具利尿、鎮痛和抗炎的作用。白梅榮等［3］通過大鼠代謝籠法、體外抑菌實驗、小鼠耳腫脹法研究比較三葉木通和五葉木通的水煎劑利尿、抑菌和抗炎作用，結果發現兩種木通的利尿等藥理作用基本相同。除此之外，木通中還具有抗癌功效的成分。白木通果無毒。江西省很多地區，如九江、萍鄉、撫州等地，長期以來白木通都作為野生水果被食用，囊肉可用于熬糖;根、莖、葉可以泡茶;皮、籽、根、莖和葉均可入藥。江西省科研技術人員通過采集白木通野生藤，經過多年馴化種植，已經培育出高產油、高結果率的新白木通果，平均產量可達3000斤/畝，最高產量可達6000斤/畝。通過對白木通籽和果皮基本組成進行成分分析，證明白木通是非常有價值的資源，急需開發利用。白木通籽是一種油料籽，有關部門已將其作為一種特種油來開發以緩解國內食用油資源緊張的壓力。白木通籽中油脂含量為39.33%、粗蛋白含量為17.89%［4］，經提取油脂后，其餅粕中含有大量的蛋白(約42%)，為提高木通籽的綜合利用，急需對蛋白進行開發研究。本文以白木通籽為原料，利用經典的堿提酸沉法，制備了白木通籽分離蛋白，系統的探討了蛋白的理化性質、功能性質及評價，旨在初步研究白木通籽蛋白的物化特性，為其應用于工業化生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白木通籽 廬山東林寺果園;大豆油 市售;牛血清白蛋白 上海藍季科技發展有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、1－苯胺基萘－8－磺酸(ANS)、β－巰基乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、溴酚藍、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等試劑 均為分析純。

KDY－9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業科技有限公司;FD－1冷凍干燥機 北京神泰偉業儀器設備有限公司;LXJ－IIB離心機 上海安亭科學儀器廠;RH basic 1磁力攪拌器、高速分散勻漿機 德國IKA公司;新世紀T6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;L8800氨基酸自動分析儀、F－4500熒光分光光度計 日本日立公司;SPX－250電泳儀 美國伯樂公司;MOS－450圓二色光譜儀 法國Bio－Logic公司;Quanta200F電子掃描顯微鏡 美國FEI公司;精密pH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料前處理 白木通籽干燥去除水分后，手工去皮，粉碎過篩，按固液比1∶3加入正己烷室溫下磁力攪拌脫脂2h，重復三次，離心、烘干正己烷后得到脫脂白木通籽粉(DAF)。

1.2.2 白木通籽分離蛋白(API)的制備 采用堿提酸沉法制備白木通籽分離蛋白:50g DAF溶解至500mL蒸餾水中，用1mol/L NaOH調節pH至10.0，溫度35℃，在磁力攪拌器上攪拌提取1.5h后離心(5000×g，15min)，殘渣重復提取2次，合并上清液。用1mol/L HCl調節上清液pH至4.5，4℃靜置30min后離心(5000×g，15min)棄去上清液，水洗，調pH至7.0后置于超低溫冰箱中－80℃預凍過夜，后置于真空冷凍干燥箱中干燥。

1.2.3 白木通籽化學組成分析 采用國家標準方法對樣品的水分、灰分、蛋白、脂肪和纖維素進行測定。

1.2.4 氨基酸組成及評價 稱取白木通籽分離蛋白0.25g，將樣品置于水解管中，加入含有10mmol/L多酚的6mol/L鹽酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷卻后定容、過濾和蒸干，采用氨基酸自動分析儀上樣測定蛋白質的氨基酸含量。氨基酸含量以g/100g蛋白表示。

1.2.4.1 氨基酸評分(%) 以 FAO/WHO(2007)［5］小孩推薦模式為參考按照如下公式計算:

1.2.4.2 九種必需氨基酸的數量與總氨基酸的數量之比 E/T(%)。

1.2.4.3 蛋白質功效比值(PER)的估算 Alsmeyer［6］等人提出的回歸方程計算:

1.2.4.4 蛋白質生物價(BV)的估算 根據Morup和Olesen［7］提出的回歸方程計算:

1.2.5 十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分析 參考 Laemmli方法［8］采用不連續緩沖液系統，濃縮膠和分離膠質量濃度分別為5%和12.5%。蛋白樣品溶解于0.05mol/L Tris－HCl緩沖溶液(含質量分數1%的SDS，1%的β－巰基乙醇，40%的蔗糖和0.02%的溴酚藍)中配制成質量濃度1mg/mL的溶液，樣品上樣前在沸水中加熱5min，離心(10000×g，10min)。取上清液10μL進樣，電泳在室溫條件下，濃縮膠中電流恒定為15mA，當樣品前沿到達分離膠時電流改為25mA。電泳結束后，用0.05%考馬斯亮藍R－250溶液(染料溶解于體積比為46∶227∶227的冰乙酸、甲醇和水混合溶液中)染色3h，后用體積比為50∶75∶875的甲醇、乙酸和水混合溶液對凝膠脫色6h。蛋白標品的分子量范圍15～170ku。

1.2.6 掃描電鏡(SEM)觀察 采用FEI公司的Quanta 200F型電子掃描顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)對蛋白顯微形態進行觀察。蛋白樣品經過粘臺、噴金等步驟后，在加速電壓為20kV的條件下用SEM進行觀察。

1.2.7 圓二色譜分析 蛋白樣品的二級結構組成采用法國Bio－Logic公司的MOS－450型旋光分光計測定。稱取一定質量的蛋白樣品，分散于10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)中使蛋白質量濃度為0.1mg/mL。測定前過微孔濾膜(0.45μm)，采用遠紫外區CD光譜，掃描范圍為190～250nm，樣品池光程1mm，每個樣品掃描三次取平均值，測定參數:分辨率1nm，捕獲時間1s，帶寬0.5nm，靈敏度100mdeg/cm。以磷酸緩沖液為空白對照［9］。

1.2.8 溶解度 將蛋白樣品溶于蒸餾水中，配制成質量分數為1%的蛋白溶液，于磁力攪拌器上攪拌30min使其充分分散，而后用 0.5mol/L鹽酸或0.5mol/L氫氧化鈉將溶液pH分別調至2～12，25℃繼續攪拌溶解30min后5000×g離心15min。用Lowry法［10］測定上清液中蛋白質的含量，以牛血清蛋白為標準蛋白。每組實驗做三組平行對照。

1.2.9 表面疏水性測定 采用熒光探針劑ANS法［11］。將樣品分散于0.01mol/L、pH7.0磷酸緩沖液中配制成1mg/mL的原液，后用相同緩沖液將其稀釋成50、100、150、200、250μg/mL 五個系列濃度的溶液。每4mL系列濃度的蛋白溶液加入50μL的1－苯胺基－8－萘磺酸(1－anilino－8－naphthalene sulfonic acid，ANS)溶液(8mmol/L ANS溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)?；靹蚝蟛捎脽晒夥止夤舛扔嫓y定，操作條件為:激發波長390nm，掃描范圍400～700nm，掃描速度500nm/min，激發狹縫和發射狹縫寬均為3nm。響應時間為0.1s，記錄470nm波長處的熒光發射強度，用熒光強度對蛋白溶液濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標。每組實驗做三組平行對照。

1.2.10 起泡性與起泡穩定性 參照文獻［12］以不同 pH(3.0、5.0、7.0、9.0)的磷酸緩沖溶液配制20mL質量濃度為1%的蛋白溶液，采用高速分散勻漿機均質1min(15000r/min)后，迅速記錄泡沫所占的體積V1;室溫下靜置30min后，再次記錄泡沫的殘余體積V2，每組實驗做三組平行對照。計算公式如式5、式 6:

式中:V0為蛋白溶液的體積，即20mL。

2 結果與分析

2.1 白木通籽化學組成分析

對白木通籽化學組成進行分析，每個成分測定三次，取平均值。白木通籽中水分為6.23%，灰分3.58%，粗脂肪38.83%，蛋白質17.23%。其中粗脂肪含量與花生中油脂含量相當，蛋白質含量略高于豆莢中蛋白含量。白木通籽經脫皮和脫脂后，油脂和蛋白含量分別為5.12%和41.83%。白木通籽分離蛋白的純度為86.04%，其提取率為82.65%?？梢?，白木通籽中蛋白含量高，經油脂加工后，脫脂粉將會作為一種新型的豐富植物蛋白資源而被大力開發。

2.2 氨基酸組成及評價

表1為白木通籽分離蛋白的氨基酸含量分析結果，并以FAO/WHO(2007)推薦模式作對照對其氨基酸進行評價。數據顯示，白木通籽分離蛋白中谷氨酸和天門冬氨酸含量最高，分別為17.84g/100g蛋白和11.63g/100g蛋白。必需氨基酸中，與 FAO/WHO(2007)2～5歲小孩的推薦模式相比，白木通籽分離蛋白含較高的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸和芳香族氨基酸;蘇氨酸和含硫氨基酸含量與之相比較低。然而，此8種必需氨基酸含量均高于FAO/WHO(2007)成人推薦模式。值得一提的是，賴氨酸一般是谷物中的限制性氨基酸，白木通籽分離蛋白中賴氨酸含量為5.91/100g蛋白，明顯高于大米中賴氨酸的含量(3.7g/100g)［13］。白木通籽分離蛋白組分與FAO/WHO(2007)小孩推薦模式相比的氨基酸評分結果顯示，蘇氨酸為白木通籽分離蛋白的第一限制性氨基酸，含硫氨基酸為分離蛋白的第二限制性氨基酸。白木通籽分離蛋白E/T值高于FAO/WHO衡量理想蛋白資源的推薦值(36%)，其PER值與優質蛋白的衡量標準值2.00相比屬于優質蛋白。

表1 白木通籽分離蛋白氨基酸分析結果(g/100g蛋白)及其氨基酸評價Table 1 Amino acid composition of API and its amino acid score

2.3 SDS－PAGE分析

圖1為白木通籽分離蛋白在還原狀態下的電泳圖譜。由圖可知，白木通籽分離蛋白的主要亞基分子量范圍為25～35ku。與傳統蛋白資源(如花生、大豆蛋白)相比，白木通籽分離蛋白的亞基分子量較小。

圖1 白木通籽分離蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.1 SDS－PAGE patterns of API

2.4 表面形態觀察

蛋白提取過程中，采用不同的萃取液制備的蛋白可能會呈現不同的分子形態結構。傳統堿提酸沉法提取得到的白木通籽分離蛋白在400、1600倍的掃描電鏡下的表面微觀結構如圖2所示。白木通籽分離蛋白的分子結構形態類似晶狀體，晶狀體結構比較疏松，分布不均勻，而且表面也不平整。

圖2 API超微結果Fig.2 Microphotograms of API in SEM

2.5 圓二色譜結果

采用遠紫外圓二色光譜測定白木通籽分離蛋白的二級結構組成。結果顯示，白木通籽分離蛋白的二級結構由11.9%的 α－螺旋，31.2%的 β－折疊，20.3%的轉角和36.6%的無規則卷曲構成，如表2所示。這說明β－折疊和無規則卷曲是白木通籽分離蛋白的主要二級結構，蕎麥蛋白中也發現了相類似的結果［14］。

圖3 白木通籽分離蛋白的圓二色譜曲線Fig.3 Circular dichroism spectroscopy of API

表2 白木通籽分離蛋白圓二色譜結果Table 2 Secondary structures of API

2.6 溶解性

蛋白質的溶解性是功能性質中最重要的一個性質，它會極大地影響其他功能性質，同時又受pH的影響。白木通籽分離蛋白溶解性隨pH的變化曲線如圖4所示。白木通籽分離蛋白的溶解性曲線呈現U形，隨著pH的增加，溶解度先降低，而后在pH5～10范圍內持續上升。在pH4～5內，蛋白溶解度呈現最低值，此時白木通籽分離蛋白的溶解度為2.10%。一般而言，蛋白質的溶解度在其等電點附近是最低的，越遠離等電點，溶解性越好。原因是在等電點時，電荷斥力消失，從而導致蛋白分子表面電荷為零［15］。白木通籽分離蛋白的高溶解性能在 pH達10.0以上呈現出來。

2.7 表面疏水性

表面疏水性表明了蛋白質分子疏水性區域的暴露程度，能夠極大地影響蛋白質的表面張力和乳化活性。表明疏水性數值越高，蛋白分子間凝聚作用力越低［16］。白木通籽分離蛋白在pH7.0時的表面疏水性為379.4。

圖4 白木通籽分離蛋白溶解度隨pH變化情況Fig.4 Solubility of API as influenced by pH

2.8 起泡性與起泡穩定性

pH對蛋白起泡與起泡穩定性的影響如圖5所示。一般而言，蛋白質的高溶解性是其擁有良好起泡性和起泡穩定性的先決條件。蛋白適當的溶解能夠增強表面吸附，對于泡沫的形成十分有利。許多蛋白在等電點附近容易凝聚，從而降低蛋白成膜的穩定性［17］。在強酸或強堿環境中，由于蛋白質表面的靜電荷增多，從而使蛋白質的溶解性能和表面活性增強，最終使蛋白的起泡性能得到增強［18］。圖5顯示，起泡性圖像與白木通籽分離蛋白的溶解性曲線呈現高度的相關性。在pH5.0處，API的起泡性值最低，為10.4%。同時，API在pH9.0處呈現最高的起泡性值(63.1%)。這種起泡性值隨著pH由5.0增加到9.0上升的現象是由蛋白質的柔性增強引起的。蛋白伸展開來使其快速分散到空氣與水界面包埋空氣顆粒，從而使起泡能力增強［19］。

圖5 白木通籽蛋白起泡穩定性隨pH變化情況Fig.5 Foaming capacity and foaming stability of API by pH

3 結論

本實驗采用堿提酸沉法對白木通籽中可溶性蛋白進行了提取，并對其理化性質與功能性質進行了分析。研究表明，白木通籽分離蛋白含17種氨基酸，其中谷氨酸和天門冬氨酸的含量相對較高，有貯藏蛋白的共性。蘇氨酸為白木通籽分離蛋白的第一限制性氨基酸。白木通籽分離蛋白的等電點在pH4～5之間，在此pH范圍內，蛋白的溶解性和起泡能力均為最低。這些結果可為白木通籽分離蛋白的開發、可食用植物蛋白質的資源開發應用提供理論依據，為開辟白木通附加值的新途徑提供參考資料。

［1］馬雙成，陳德昌，趙淑杰.蕷知子的化學成分研究I.白木通種子中的3位單糖鏈皂甙化合物［J］.中草藥，1994，25(4):171－174.

［2］劉占朝.三葉木通研究進展綜述［J］.河南林業科技，2005，25(1):20－22.

［3］白梅榮，張冰，劉小青，等.三葉、五葉木通提取物藥效及對藥酶影響的比較研究［J］.中華中醫藥學刊，2008，26(4):732－735.

［4］蔣巖，杜研學，熊華，等.白木通籽油的理化性質與熱氧化穩定性［J］.食品科學，2011，32(15):34－38.

［5］潘敏堯.大米濃縮蛋白的研制及蛋白改性的研究［D］.杭州:浙江大學，2006.

［6］RH Alsmeyer，AD Cunningham，M L Happich.Equations predict PER from amino acid analysis［J］.Food Technology，1974(28):34－38.

［7］IK Morup，ES Olesen.New method for prediction of protein value from essential amino acid pattern［J］.Nutrition Report Kit，1976(13):355－365.

［8］Laemmli U K.Cleavage of saturated proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227:680－685.

［9］F Massimo，Marcone，Y Kakuda，et al.Salt－ soluble seed globulins of dicotyledonous and monocotyledonous plants II.Structural characterization［J］.Food Chemistry，1998，63(2):265－274.

［10］Lowry O H，Rosembroug H J，Lewis A，et al.Protein measurement with the Folin Phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193(1):265－275.

［11］Haskard C A，Li－ Chan E C Y.Hydrophobicity of bovine serum albumin and ovalbumin using uncharged(PRODAN)and anionic(ANS－)fluorescent probes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(7):2671－2677.

［12］Sze－Tao K W C，Sathe S K.Functional properties and in vitro digestibility of almond(Prunus dulcis L.)protein isolate［J］.Food Chemistry，2000，69(2):153－160.

［13］Eknayake S，Jansz E R，Nair B M.Proximate composition，mineral and amino acid content of mature Canavalia guadiata seeds［J］.Food Chemistry，1999，66(1):115－119.

［14］Tang C H，Wang X Y，Liu F，et al.Physicochemical and conformational properties of buckwheat protein isolates:influence of polyphenol removal with cold organic solvents from buckwheat seed flours［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(22):10740－10748.

［15］Chavan U D，McKenzie D B，Shahidi F.Functional properties of protein isolates from beach pea(Lathyrus maritimus L.)［J］.Food Chemistry，2001，74(2):177－178.

［16］Hojilla－ Evangelista M P，Evangelista R L.Functional properties of protein from Lesquerella fendleri seed and press cake from oil processing［J］.Industrial Crops and Products，2009，29(2):466－472.

［17］Mwanjala A M，Kharidah M，Jamilah B，et al.Influence of altered solvent environment on the functionality of pigeonpea(Cajanus cajan)and cowpea(Vigna unguiculata)protein isolates［J］.Food Chemistry，2000，71(2):157－165.

［18］DiaelDin M R，Elfadil E B，Abdullahi H E.Fractionation，solubility and functional properties of cowpea(Vigna unguiculata)proteins as affected by pH and/or salt concentration［J］.Food Chemistry，2004，84(2):207－221.

［19］Chau C F，Cheung K，Wang Y S.Functional properties of protein isolates from three indigenous legume seeds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(7):2500－2503.