穿梭蛋白核仁素的多種生物學功能

賀 欣(綜述)，宋娜玲，孟愛民(審校)

(北京協和醫學院，中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

穿梭蛋白核仁素的多種生物學功能

賀 欣(綜述)，宋娜玲，孟愛民※(審校)

(北京協和醫學院，中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

核仁素(又稱C23)是一段進化保守的核仁-胞質-細胞膜穿梭蛋白，是真核細胞核仁中含量最豐富的蛋白之一;它含有三個結構域，具有多種配體結合活性，在調控細胞分化、增殖、胚胎發生、核糖體合成與成熟、細胞凋亡、病原體侵襲等方面發揮著廣泛的生物學功能。在此根據核仁素在細胞內和細胞膜兩種物理定位分為兩個方面分別介紹其發揮的生物學活性和與其結合的相應配體，揭示特異性干涉其活性的途徑。

核仁素/C23;穿梭蛋白;配體;個性化治療

核仁素(又稱C23)是核仁中含量最豐富的非核糖體蛋白之一，由于其含有豐富的帶負電荷的酸性殘基，它在電泳遷徙中表現出的條帶在相對分子質量110 000附近。該蛋白在脊椎動物中高度保守，在植物和酵母中也存在類似物。核仁素是一種穿梭蛋白，也是一種DNA/RNA結合蛋白，在不同類型的細胞，或者相同類型細胞的不同分化階段，它可能存在于不同部位。它在核仁，胞質和一部分細胞的細胞表面通過多種機制發揮著廣泛的生物學功能，包括調控核糖體的生物合成與成熟，調控細胞增殖、生長、胚胎發生、胞質分裂、染色質復制與核仁的發生，促進細胞增殖，抗細胞凋亡，協助病原體侵襲等作用。

核仁素主要有三個結構域：N端結構域存在核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，富含酸性殘基，含有酪蛋白激酶2和細胞周期蛋白依賴性激酶1的多個磷酸化位點;中央域包含4個RNA識別基序(RNA recognition motifs，RRM)，又稱為 RNA 結合結構域(RNA binding domain，RBD);C-末端富含甘氨酸和精氨酸(Gly/Arg-rich，GAR)。核仁素的結構特點賦予其多種配體結合活性，從而發揮了廣泛的生物學功能，下面將分兩個方面介紹核仁素的結合特性以及其發揮的功能。

1 細胞內的核仁素發揮的功能及其配體

1.1 組蛋白分子伴侶活性核仁素氨基端含有由4個酸性α螺旋，酸性基團與組蛋白通過離子鍵相互作用賦予核仁素組蛋白分子伴侶(histone chaperone)活性。核仁素在促進RNA轉錄，染色質模板的動態組裝方面具有重要作用。染色質組裝有兩個重要步驟：H3-H4四聚體組裝和其之后的兩個H2A-H2B二聚體的組裝，核仁素與H2A-H2B二聚體直接結合形成可溶的穩定的結合物，從而幫助核小體在裸DNA上的組裝，核仁素在組蛋白裝配過程中發揮的效果從數量上和質量上都接近于另外兩個明確特征的組蛋白分子伴侶：核質蛋白(nucleoplasmin)和核小體裝配蛋白1(nucleosome assembly protein-1，NAP-1)。

1.2 促進核糖體轉錄，裝配和成熟活性 核仁素中心區RBD和交替排列的疏水與親水結構可與pre-rRNA結合形成莖環結構(stem-loop structure)，并與其他核糖核蛋白一起形成一個大的剪接復合體。核仁素羧基端富含甘氨酸殘基并散在分布著二甲精氨酸與苯丙氨酸。該結構不僅可以減少堿的堆積和 RNA二級結構的形成，還有利于RNA接近RBD結構，有利于核仁素對RNA的識別、包裹及轉運。核仁素通過識別、包裹pre-rRNA從而促進原初轉錄產物45S rRNA剪接并斷裂，生成成熟的rRNA(18S，28S，5.8S)。

1.3 參與基因轉錄調節 核仁素具有DNA結合并與其他蛋白共同作用參與基因轉錄調節的活性。核仁素參與結合Emu基因增強子并進一步調節轉錄;核仁素能與核糖核蛋白C共同結合于前淀粉酶基因的啟動子并介導前淀粉酶基因的轉錄;在對造血干細胞增殖機制的基礎理論研究中發現，核仁素對C基因起轉錄激活作用［1］;核仁素通過抑制p53依賴途徑保持胚胎干細胞的自我更新［2］，為進一步研究核仁素作為干細胞生長因子的可能性奠定基礎。

另外，核仁素直接參與MicroRNAs合成［3］，核仁素的細胞定位和水平與miR-15a/16水平直接相關。

1.4 促細胞增殖和抗細胞凋亡活性 核仁素通過其RBD與多種凋亡相關基因的mRNA的5'和3'UTR結合，使相應的mRNA穩定或去穩定，從而起到促進細胞增殖和抗細胞凋亡作用。

1.5 穿梭特性 作為一種非組胺磷酸蛋白，核仁素通過N端結構域存在核定位信號，另外，其中心區的RBD和羧基端GAR區與核仁其他結構(蛋白質和RNA)的共價結合，也對其穩定存在于真核細胞核仁的致密纖維組分與顆粒區作出了貢獻。Huang等［4］發現血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及Ecm成分可以促使核仁素從胞質向胞膜轉運。細胞周期依賴性激酶2誘導核仁素N端區域絲氨酸蘇氨酸的磷酸化促使其向胞質移位;相反，去磷酸化則促進其向核轉位［5］。目前核仁素的穿梭機制尚未完全明了，從核仁向胞質移位的過程依賴于完整的細胞骨架和非肌肉肌球蛋白重鏈9(nonmuscle myosin heavy chain 9，MyH9)，MyH9 作為細胞膜表面核仁素與細胞骨架之間的生理連結者，從而促進核仁素在細胞內的移位。MyH9基因剔除和MyH9過表達突變均能明顯抑制核仁素的細胞膜定位和新生血管的生成［4］。也有研究［6］認為核仁素的轉運可能與p53的激活有關，當細胞受到刺激后，可即刻誘導核仁素和p53復合物的形成。

核仁素的這種穿梭特性，一方面使其作為一種載體，攜帶核糖體蛋白質轉入細胞核和核仁，完成核糖體亞單位的組裝;另一方面能夠將組裝好的核糖體亞單位從細胞核運出至細胞質。

2 細胞膜核仁素發揮的功能及其配體

在Hela(宮頸癌細胞)細胞中，胞質核仁素以囊泡形式轉位到膜表面，與配體結合后向細胞核轉運［7］;利用雙重免疫熒光染色法發現核仁素和肌動蛋白共定位于細胞膜表面，并且發現細胞松弛素D(肌動蛋白聚合特異性抑制劑)能明顯影響核仁素在HeLa細胞膜表面的定位;核仁素的膜定位與溫度亦存在一定的關系，在37℃時細胞膜表面核仁素的表達明顯增加，但在室溫或5℃時則減少。多位研究者在多種腫瘤細胞(如肝癌細胞、白血病細胞、乳腺癌細胞、橫紋肌肉瘤、淋巴瘤細胞等)，免疫細胞(如人T、B細胞和單核-巨噬細胞系統等)以及正常細胞(如血管內皮細胞、神經細胞、喉上皮細胞、肌肉、大鼠心肌細胞、鼠睪丸細胞、小鼠肌原細胞、小鼠巨噬細胞等)的細胞膜表面發現核仁素的存在。

核仁素以磷酸化的形式存在于細胞膜表面，作為許多不同配體的細胞表面受體，包括生長因子(即堿性成纖維細胞生長因子)和趨化因子(即中期因子)。

2.1 介導抗血管生成和抗腫瘤作用 最近的研究顯示，腫瘤細胞表面的核仁素可作為多種配體的受體，與相應配體結合介導相應的腫瘤生物學行為。在正常肝細胞中，核仁素只表達于細胞核內，呈點狀陽性;在肝癌細胞中表達量增加，且表達模式發生了變化，提示核仁素在肝細胞癌發生中起了重要作用［8］。

Christian等［9］發現核仁素可以作為新生成血管內皮細胞的表面標志物。通過對核仁素的功能阻止和表達下調，可以抑制內皮細胞的遷徙和毛細血管的形成。Acharan sulfate(AS)具有抗血管生成、抗凝血、抑制細胞分裂、免疫調節功能以及抗腫瘤等效應。Kim等［10］利用生物素標記路易肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)細胞，AS親和層析分離細胞裂解物，通過質譜和Western-blot技術從AS的細胞膜結合蛋白中篩選到核仁素，提示AS通過與細胞膜表面核仁素結合，在細胞膜內吞作用下進入細胞質，進一步觸發細胞內通信而發揮生物學效應。

Legrand等［11］通過研究發現乳鐵蛋白亦可以與細胞膜表面核仁素結合并內吞入靶細胞內。最近，Shi等［12］報道內皮抑素(endostatin)的抗血管生成和抗腫瘤作用由細胞表面的核仁素介導。內皮抑素與腫瘤細胞和周邊血管內皮細胞表面的核仁素高親和力結合。核仁素和內皮抑素可在腫瘤組織血管內皮細胞表面共顯色;阻斷細胞表面核仁素會導致內皮抑素失去其抗血管生成活性。

Porkka等［13］報道在體外和體內實驗表明腫瘤歸巢肽F3與核仁素結合，進一步內化到腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞核內。Drecoll等［14］采用F3二聚體攜帶α粒子發射體213Bi，通過F3與血管腫瘤細胞表面的核仁素高親和力結合使得213Bi-DTPA-［F3］2在腫瘤細胞核聚集(體外實驗)，在腹腔腫瘤聚集(體內試驗)，對腹膜癌起到有效的治療作用，采用213Bi-DTPA或者PBS處理的荷瘤鼠平均生存時間為51 d和53 d，而213Bi-DTPA-［F3］2 處理的荷瘤鼠平均生存時間為93.5 d，有顯著性差異。

富含鳥嘌呤寡核苷酸(G-rich oligonucleotides，GROs)通過分子間和分子內作用形成四鏈或者四聯體結構，該結構與靶點通過形狀特異識別結合，類似于抗原抗體結合，從而發揮不同尋常的生物物理和生物特性。GROs可能的靶點之一便是腫瘤細胞及周邊血管細胞表面的核仁素。人工合成的活性GROs作為適體(aptamers)可參與治療多種人類疾病。AS1411［15］作為 GROs類的典型代表，目前已經進入腫瘤治療的Ⅱ期臨床研究。作為治療藥物，GROs具有許多超越于單克隆抗體或其他寡核苷酸治療途徑的優點，例如無免疫原性，熱穩定性良好，對血清核酸酶穩定，細胞攝取率高等。

2.2 協助病原微生物感染 人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染靶細胞時首先通過包膜糖蛋白gp120-gp41黏附到宿主細胞膜上的受體復合物CD4分子和趨化因子受體家族(CXCR4/CCR5)，進而與靶細胞膜融合，使HIV病毒進入宿主細胞。近年來研究表明，多種配體通過與細胞膜表面的核仁素結合而抑制HIV感染。Said等［16］利用激光共聚焦顯微鏡發現核仁素與生長因子Midkin(MK)、Pleiotrophin(PTN)共定位于細胞膜上，并且生長因子MK和PTN以細胞膜上的核仁素為低親和力受體，進而發揮其抗HIV感染的作用。

Nisole等［17］發現一種抗艾滋病假肽代號為HB-19可與細胞膜上的核仁素結合形成不可逆的復合物，進而抑制HIV通過核仁素黏附到宿主細胞上，運用各種突變體進一步證實HB-19的結合位點在核仁素羧基端區域的GAR結構區。

這些研究表明，細胞膜表面核仁素可能作為HIV黏附的共受體在HIV的致病機制中發揮重要作用，而這些與胞膜核仁素結合的配體則可能是潛在的抗HIV感染抑制劑。

除了HIV以細胞膜上的核仁素為受體外，其他如腺病毒伴隨病毒2(adeno associated virus-2，AAV-2)、副流感病毒(human parainfluenza virus-3，HPIV-3)、柯薩奇B病毒以及腸出血大腸埃希菌均可以細胞膜上的核仁素為共受體，完成對宿主細胞的黏附與在宿主體內的定植。腸出血大腸埃希菌O157：H7表達的外膜蛋白Intimin-γ與喉上皮細胞膜定位的核仁素結合后可以促進細菌定植基座的形成，同時用抗核仁素抗體預處理后能明顯抑制細菌黏附。核仁素與丁型肝炎抗原氨基末端相互作用可調節丁型肝炎病毒復制。

2.3 調節免疫反應 Hirano等［18］發現凋亡早期的Jurkat細胞(T淋巴細胞)表面CD43分子包含的多糖鏈可作為一種配體分子與人單核細胞膜表面的核仁素結合，從而激活人單核細胞對Jurkat細胞的識別與吞噬?？笴D43抗體、抗核仁素抗體、寡糖鏈預處理人單核細胞后均可以抑制人單核細胞對早期凋亡細胞識別與吞噬。人單核細胞膜表面核仁素參與介導脂多糖所致早期炎性介質白細胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達與分泌［19］，促進脂多糖所致的 IL-1β 釋放［20］。

L-選擇素在調控白細胞以及白細胞與血管內皮細胞黏附中起重要作用，利用親和層析法和質譜技術從白細胞和造血祖細胞膜蛋白中篩選出核仁素作為L-選擇素配體之一。核仁素通過L-選擇素參與調控白細胞之間及其與血管內皮細胞之間的黏附。

Jurkat細胞、U937(單核細胞)細胞膜表面核仁素可與補體抑制劑(factor J)特異性結合，之后被內翻入細胞內，從而調節細胞之間的黏附。核仁素抗體可以抑制Jurkat細胞與factor J之間的黏附;同時也發現核仁素與factor J結合后，細胞內一些酪氨酸蛋白的磷酸化也明顯增加，提示factor J對細胞黏附能力的調節依賴于細胞膜表面核仁素及隨后酪氨酸蛋白的磷酸化。

2.4 介導神經分化和發育 層粘連蛋白(laminin)所包含的IKVAV序列能夠和細胞膜上的核仁素結合，從而參與調控原始神經細胞和其他神經細胞的分化;并且核仁素在成熟的大腦和分化的神經細胞有較高的濃度，提示核仁素在神經組織的分化中起重要作用。

Caudle等［21］發現在帕金森病細胞模型中，核仁素與帕金森癥發展進程中的兩個關鍵蛋白α-synuclein和DJ-1存在相互作用。最近研究表明，核仁素在人帕金森病患者黑質致密體中與正常對照組相比顯著減少。在帕金森病體外模型中，控制核仁素可導致魚藤酮處理之后的氧化應激和蛋白酶體抑制的顯著改變。有趣的是，核仁素表達并不影響線粒體復合物Ⅰ的活性，表明存在其他的特異性氧化應激和蛋白酶體途徑。

3 結語

作為一種多功能穿梭蛋白，核仁素眾多生物學功能的機制尚未被完全了解，而其具有的潛在生物學意義或許還有很多未被發現;對它的研究將涉及微生物學、免疫學、細胞生物學等多學科領域。以核仁素為切入點的治療策略正在為疾病尤其是腫瘤的個性化治療帶來新的希望。

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Biological Functions of Shuttling Protein—Nucleolin

HE Xin，SONG Na-ling，MENG Ai-min.(Institute of Radiation Medicine of Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Tianjin300192，China)

Nucleolin(also called C23)is a highly-conserved protein which can shuttle between nucleus，cytoplasm and cell membrane，one of the most abundant proteins in nucleus;it can bind to various ligands with its three domains，modulating a wide range of biological functions such as cell differentiation，cell proliferation，embryogenesis，ribosome synthesis and maturity，apoptosis，pathogens invasion and so on.Here，we foucus on its functions and the corresponding ligands inside and outside of the cell，revealing ways of specifically interfering its activities.

Nucleolin/C23;Shuttling protein;Ligands;Personalized treatment

R34

A

1006-2084(2012)13-1961-04

中國醫學科學院放射醫學研究所發展基金(SF1004)

2011-10-26

2011-12-26 編輯：潘雪