骨形態發生蛋白2緩釋載體的研究進展

張以財，焦力剛(綜述)，閆景龍(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨四科，哈爾濱 150001)

骨形態發生蛋白2緩釋載體的研究進展

張以財△，焦力剛△(綜述)，閆景龍※(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨四科，哈爾濱 150001)

自體骨移植一直是骨修復的“金標準”，但仍存在一些問題。異體骨移植同樣存在著骨愈合緩慢及排斥反應等問題。隨著組織工程學的發展，應用骨組織工程方法來修復骨缺損成為研究熱點。骨組織工程主要包括支架材料、種子細胞、生長因子三個方面。骨形態發生蛋白2是目前最強的促骨生長因子，其在體內半衰期很短，必須依靠緩釋載體才能發揮其較長效的促骨生長作用。

骨形態發生蛋白2;骨組織工程;緩釋載體

由創傷、炎癥、腫瘤等原因所致的骨缺損是除骨折所致骨不連外影響功能的主要原因，目前主要以自體骨移植的“金標準”治療為主，但仍然存在供骨區損傷、術后并發癥等問題。隨著生物材料制作移植替代物組織工程學的發展，應用骨組織工程來修復骨缺損也成為當前的研究熱點，骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是現今已知的最強的促骨生長因子，對骨的生長具有重要的調節作用［1-2］。BMP-2 在體內的半衰期很短，只有16 min，很快被體液轉運或降解，難以發揮其長效促骨生長作用，必須依靠緩釋載體來避免藥物快速降解，使其達到緩慢釋放，從而延長其作用時間。

1 無定形磷酸鈣納米緩釋微粒

無定形磷酸鈣納米(amorphous calcium phosphate，ACP)是一類X線衍射為非晶態的磷酸鈣材料的總稱，具有典型的無定形物質的球形面貌。研究發現ACP的成骨細胞黏附性及骨傳導性較羥基磷灰石好［3］，生物降解速率比可降解的磷酸三鈣高［4］，它的細胞毒性小，具有良好的生物活性，能明顯促進細胞增殖，提高堿性磷酸酶活性并增進骨橋蛋白的合成［5-6］。沈素祥等［7］實驗發現重組人骨形態發生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/ACP緩釋微粒具有2個快速釋放rhBMP-2的時段：第一個快速上升相發生在第1～5天，第二個快速上升相持續時間為5～15 d，此后該微粒呈緩慢持續釋放達30 d。第二個快速釋放階段的提前出現使局部聚集更多的rhBMP-2，提高了作用效果。緩釋微粒具有良好的降解性能，它的降解速率與新骨形成的速度大致相當，使緩釋微粒的降解和新骨的形成保持了良好的動態平衡。ACP是rhBMP-2合適的緩釋載體材料，負載后rhBMP-2的生物活性未受影響，生成的緩釋微粒具有良好的降解性能和促成骨活性，值得進一步研究和探討。

2 高分子殼聚糖

高分子殼聚糖具有促進吸收、黏膜黏附和可控制藥物釋放的功能，負載蛋白質類藥物，對蛋白質進行有效保護，避免藥物的快速降解，提高藥物穩定性，提高骨填充材料的組織相容性［8-9］。殼聚糖凝膠在控制藥物釋放方面被認為是有希望的生物可降解聚合物［10］，而且殼聚糖本身就有生長因子活性［11］。王丁丁等［12］實驗證明緩釋型rhBMP-2/殼聚糖生物骨修復材料具有較強的骨再生活性，不僅具有良好的生物相容性和力學性能，而且可以保持rhBMP-2的生物活性，并實現rhBMP-2的持續緩慢釋放，能更好地滿足多種原因所致骨缺損的修復要求。殼聚糖與rhBMP-2混合后能在材料表面形成均勻的藥膜并且緩釋性能較好，考慮到目前使用的材料為異種骨來源，雖經過處理，但仍具有一定的免疫原性，臨床應用受限，因此下一步準備單獨將殼聚糖與rhBMP-2的混合比例進行優化、凍干后制備殼聚糖藥膜，并對其理化性能作進一步研究。由于可注射的生物材料在手術操作中具有較小侵襲性，使其在矯形外科應用中非常有益。Kim等［13］在不同的細胞培養基中加入負載BMP-2的殼聚糖凝膠復合物，發現與加入同等量BMP-2的對照組相比堿性磷酸酶活性有明顯的提高，礦物質鈣沉積也有明顯增加。雖然可注射殼聚糖凝膠提高了BMP-2緩釋效能和礦化能力，但可注射的生物材料通常不具有限定的孔徑結構，限制了其進一步應用。

3 淀粉聚ε-己內酯微粒

臨床上應用膠原基質常需要負載大劑量BMP-2生長因子，而大劑量BMP-2最終會導致骨質增生、異位骨化等問題。Balmayor等［14］介紹了一種新型注射給藥系統淀粉聚ε-己內酯(starch-poly-e-caprolactonemicroparticles，SPCL)微粒負載 BMP-2。SPCL微粒能夠負載BMP-2并且具有良好的生物活性，體外實驗證實BMP-2快速釋放發生在第12小時，并在2 d后達到高峰，此期之后進入平臺期，持續到結束，到第10天時約60%的BMP-2被釋放。SPCL微粒包裹BMP-2的量比理論值小，雖有一定局限性，但仍顯示出了良好的生物活性且在給藥傳遞過程中未受到損害。此實驗為體外實驗，應用于體內可能會產生免疫反應。膠囊化的BMP-2的性能低于其他文獻報道，避免了膠囊化過程采用的高溫對BMP-2活性的影響和有機溶劑對機體的損害?？傊?，SPCL微粒負載低濃度BMP-2具有良好的生物活性和組織相容性，其持續釋放性能好，可作為一種受控/緩釋載體成功應用于骨組織工程。

4 納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸與p24

p24是一種新型短鏈BMP-2相關肽，能夠規則黏附和使骨髓間質細胞分化，誘導異位成骨［15-16］。p24具有性能穩定、成本低等優點。Li等［17］將納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸分別與p24和rhBMP混合，在修復鼠顱骨缺損的體內實驗中證實在12周經X-線、CT三維重建及組織學觀察證實3 mg的p24與1 μg的rhBMP在骨誘導方面作用類似。由于p24活性比BMP-2活性低，需要進一步研究使其氨基酸序列得到優化，并證實p24與BMP-2之間存在劑量-效應關系。

5 生物可降解明膠微粒

Patel等［18］將明膠微粒植入聚乳酸-聚乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)支架形成復合支架，將不同劑量的BMP-2負載入復合支架中，發現明膠微粒中的BMP-2在最初的突釋之后存在直線性釋放動力，且不同含量BMP-2復合明膠后達到的平衡值與劑量沒有明顯的依存關系。明膠微粒合成時預處理條件的不同可能導致明膠微粒在酸性和堿性環境下產生一定的差異。在堿性條件下明膠主要是降低BMP-2的釋放，在10、40 mmol/L兩種濃度的戊二醛明膠微粒中證明交聯程度高的明膠微粒能降低BMP-2的釋放，膠原酶會增加BMP-2的釋放，而明膠經歷酶降解的速率取決于其交聯程度。綜上所述，BMP-2釋放的劑量效應不明顯，而不同的明膠類型和釋放介質可以改變其釋放動力學。這些結果證明通過改變堿性明膠微粒交聯的程度可以系統地控制BMP-2從明膠微粒中的釋放。

6 脂質微管

作為緩釋載體的脂質微管制備系統能有效避免有機溶劑和高溫等處理對BMP-2活性的影響［19-20］。Johnson等［21］將負載BMP-2的脂質微管作為緩釋載體，體外實驗發現隨著脂質微管濃度的增高負載的BMP-2也增高，最高可達90%。堿性磷酸酶和Masson染色驗證了其中的BMP-2具有生物活性，證明脂質微管可作為緩釋載體應用于骨組織工程中。

7 肝素鈉修飾的透明質酸凝膠微粒

Xu等［22］用 AOT/水/異辛烷反相乳液聚合體系法成功地合成了含有共價固定化肝素的透明質酸凝膠顆粒，該顆粒呈球形，具有納米多孔結構，在含水的培養基中易于分散，對BMP-2具有較高的負載能力且對BMP-2具有顯著的初始突釋性。在BMP-2控釋方面，肝素化的肝素鈉修飾的透明質酸凝膠微粒能夠提供一個可親和的給藥系統，肝素含量為0.55 μg/mg的混合微粒為最佳，其釋放動力學接近0級。在結合體內透明質酸情況下，負載了BMP-2的肝素鈉修飾的透明質酸凝膠微粒能誘導小鼠間充質干細胞持續強烈地向成骨細胞分化?？梢?，肝素鈉修飾的透明質酸凝膠微粒作為BMP-2的緩釋載體具有一定的優勢。

8 電紡纖維支架

Srouji等［23］在電紡纖維支架中改變聚乙酸內酯/聚乙二醇比率，通過調整孔徑的大小發現小孔徑支架能減慢BMP-2釋放，而緩慢釋放狀態的BMP-2能顯著提高骨修復過程中堿性磷酸酶的活性，而且能加速成骨細胞分化，加快骨缺損修復的過程。此支架為骨組織工程修復骨缺損的臨床應用提供了一個有希望的外科工具。

9 纖維蛋白/透明質酸表面修飾的聚己內酯/PLGA

Kang 等［24］用 Solid freeform fabrication(SFF)方法制造了PCL/PLGA支架，并經纖維蛋白/透明質酸浸泡、冰凍速干法制成纖維蛋白/透明質酸表面修飾的PCL/PLGA支架，消除了加熱過程，避免了高溫對BMP-2造成的破壞，證明了纖維蛋白/透明質酸涂層支架具有顯著增強原始細胞黏附的能力。在體外，纖維蛋白/透明質酸涂層支架將BMP-2釋放持續3 d，能刺激種植在支架上的脂肪基質細胞更持續、有效地釋放堿性磷酸酶達10 d甚至更長。更重要的是，未分化脂肪基質細胞接種到負載BMP-2的纖維蛋白/透明質酸涂層支架上顯示了更好的刺激骨形成及礦化能力。

10 聚氨基甲酸乙酯

Brown等［25］用擁有不同rhBMP-2緩釋動力的可降解聚氨基甲酸乙酯和聚氨基甲酸乙酯/PLGA微球復合支架與膠原明膠載體系統在臨界大小的鼠股骨缺損模型進行對比，Micro-CT分析表明具有突釋并持續緩釋rhBMP-2的聚氨基甲酸乙酯支架與負載rh-BMP-2膠原明膠相比，能夠產生超過50%的新生骨，沒有突釋過程的rhBMP-2的持續緩釋與沒有rhBMP-2的支架相比不能形成更多的新生骨。在臨界大小的鼠股骨缺損模型中，這種增強的藥動學能夠產生更多的新生骨。

11 PCL

Bae等［26］用負載BMP-2的PCL支架模仿自然愈合過程中BMP的表達方式，采用不連續的三階段釋放模式證明了其具有發揮協調額外骨空間形成的重要作用，與空白對照組、無BMP-2的PCL支架組相比，負載BMP-2的蜂窩狀PCL支架能夠加速兔尺骨骨缺損愈合。具有多孔結構的聚已內酯可作為緩釋載體用于骨組織工程中。

12 納米羥基磷灰石

Xie等［27］將納米羥基磷灰石作為緩釋載體，先將納米羥基磷灰石浸入不同濃度(0～4000 μg/mL)的BMP-2溶液中，發現其吸附量與BMP-2溶液的濃度具有高度相關性，納米羥基磷灰石吸附BMP-2量最高達70 μg/mg，緩釋載體中的BMP-2的釋放持續15 d以上。納米羥基磷灰石具有作為藥物載體系統的潛在功能，在骨組織工程中可作為支架材料。

13 PLGA微粒及3D支架

傳統支架制作方法不能控制支架內外結構、孔徑、孔隙率及內部連通，為了克服這一缺點，Lee等［28］應用SFF方法制成了埋入BMP-2的微粒，用微粒體光刻技術將微粒摻入聚丙烯延胡索酸/富馬酸二乙酯光聚合物懸液制成3D支架，支架保持規則孔徑并連接所有孔道，經試驗證實包含微粒的3D支架能持續穩定的緩釋生長因子。單純負載BMP-2的PLGA微粒在第3天開始釋放并持續14 d，而復合微粒的支架直到7 d才開始釋放，BMP-2經過7 d釋放后呈現直線型釋放并持續到28 d。SFF支架在骨再生方面優于傳統的靠微粒過濾/氣體泡騰法制成的支架，即使在微粒體光刻技術支架孔率低于傳統支架的情況下依然在黏附增殖方面具有明確的優勢，體內試驗證實內部孔隙交聯及內部結構使SFF支架在骨再生方面有重要作用。然而，傳統支架能使血液瘀滯，血液內部的干細胞能黏附在支架上并形成骨內核，而SFF支架在植入干細胞方面比較困難，有待進一步研究。

14 結語

應用骨組織工程修復骨缺損和修補機能不良骨仍然是研究熱點，目前的戰略主要基于合適的支架材料、種子細胞、生長分化因子三個部分組成［29］。BMP-2是現今認為最強的促進骨生長分化的因子，亦是緩釋載體主要負載的生長分化因子。隨著研究的深入，緩釋載體制備方法有了進一步提高，在載體突釋與持續釋放問題、緩釋載體制備降解過程對細胞的影響方面取得了一定的進步。緩釋載體還存在這樣或那樣的不足，實驗研究與臨床應用還有一定距離，作為BMP-2緩釋載體的臨床應用有待進一步研究。

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Research Progress of Bone Morphogenetic Protein-2 Controlled-release Carrier

ZHANG Yi-cai，JIAO Li-gang，YAN Jing-long.(Bone Department Four，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical U-niversity，Harbin150001，China)

Autogenous bone graft has long been the ＂golden standard＂of bone repair，while there are some remaining problems.Allograft also have many problems，such as slow bone healing and rejection etc..With the development of tissue engineering，lots of eyes focus on bone tissue engineering to repair bone defects.There are three key points in bone tissue engineering namely scaffolds，seed cells and growth factor.Bone morphogenetic protein-2 is the most efficient factor to promote bone growth so far，but it has a very short half-time in vivo，which must rely on control-released carrier to fulfill its long-term bone growth-promoting effect.

Bone morphogenetic protein-2;Bone tissue engineering;Controlled-release carrier

R318.08

A

1006-2084(2012)13-1989-04

2011-12-05

2012-01-04 編輯：伊姍