細菌抗腫瘤作用的研究

楊旭光(綜述)，楊志奇，孫振綱(審校)

(長江大學附屬荊州臨床醫學院肝膽外科，湖北荊州 434020)

細菌抗腫瘤作用的研究

楊旭光△(綜述)，楊志奇※，孫振綱(審校)

(長江大學附屬荊州臨床醫學院肝膽外科，湖北荊州 434020)

惡性腫瘤對傳統抗腫瘤療法的抵抗促使人們尋找新的更有效的腫瘤治療方法。研究顯示某些細菌在感染人體后對腫瘤細胞生長有抑制作用，某些細菌可以在腫瘤組織中高度聚集，因此可能被用作抗腫瘤藥物或基因的載體，細菌毒素同樣顯示出抗腫瘤的作用，目前對一些細菌已經進行了Ⅰ期臨床試驗，但各種細菌(包括致病性細菌)與腫瘤的關系仍然有待于進一步研究。

抗腫瘤;傷寒沙門菌;銅綠假單胞菌;細菌制劑;生物治療

傳統的腫瘤治療方法雖然對某些特殊類型的腫瘤及一些早期惡性腫瘤有較好的效果，但低氧條件下化療的細胞毒作用，手術操作的過程都有可能選擇出惡性程度更高、更容易轉移的癌細胞，對放化療抵抗力更強的癌細胞，并且有使癌細胞擴散轉移的可能［1］?？傮w來講，傳統療法抗腫瘤治療效果還不能令人滿意，而細菌抗腫瘤有其特殊的優勢，因為實體腫瘤組織生長迅速，內部血管分布不均，致使腫瘤內多屬低氧代謝環境［2］，而細菌本身對乏氧腫瘤組織有很強的選擇性［3］，能夠在腫瘤組織中聚集并繁殖，而且有的直接抗腫瘤作用，有的可作為抗腫瘤藥物載體運輸或在腫瘤組織合成腫瘤細胞毒性分子，另外細菌可以被有效的抗生素清除，其不良反應明確并可控。細菌可以向腫瘤組織中心部位運動，可以刺激機體產生抗腫瘤效應分子，細菌毒素同樣顯示出有抗腫瘤的作用。盡管細菌及其制劑在抗腫瘤的歷史中遭受過挫折［4-5］，但現在細菌抗腫瘤的作用正在重新引起人們的重視。

1 傷寒沙門菌

1.1 傷寒沙門菌抗腫瘤的作用機制特點 傷寒沙門菌是研究和使用最早的抗腫瘤細菌。過去應用滅活傷寒沙門菌制劑通過血液途徑給藥，發揮作用依賴血管的分布和有效的組織液濃度，不在血管外組織累積，幾乎沒有選擇性，因此對腫瘤細胞作用有限，而具有運動能力的活細菌可以跨越灌注和壓力梯度到血液分布少的腫瘤組織。

Forbes等［6］研究了幾種候選傷寒沙門菌在腫瘤組織中聚集的機制，包括在腫瘤組織混亂的血管系統中停滯，被腫瘤特殊的微環境吸引，與腫瘤微環境的相互適應性反應。在系統靜脈注射傷寒沙門菌到荷瘤小鼠后，相差顯微鏡和組織技術定量觀察細菌和腫瘤血管的相互作用。發現在靜脈注射后立刻有少量細菌黏附到腫瘤血管，注射后一周腫瘤組織中細菌數量是其他正常組織的10 000倍，充分顯示了它們的特異性。腫瘤組織中的細菌定植在壞死區，距功能血管約750 μm。以上這些說明傷寒沙門菌黏附在腫瘤血管的能力有限，在腫瘤組織移動能力不足，只在腫瘤的壞死組織生存下來。傷寒沙門菌有很強的腫瘤組織特異性，增強它的運動能力應該可以提高治療效果。

傷寒沙門菌可以在腫瘤組織中定植，但是目前對這種特異定植的機制知之甚少，Ganai等［7］研究了BALB/c小鼠乳腺癌4T1模型靜脈注射鼠傷寒沙門菌后腫瘤組織中及周圍的細菌含量與時間的關系，免疫組織化學法檢測了凋亡，在核心、轉移區、瘤體、邊緣四個區域測量了細菌離開血管到定植點的距離，還檢測率肺轉移瘤和肝臟轉移瘤中的細菌，測出沙門菌菌落增長1倍所需時間為16.8 h，細菌定植確定延遲腫瘤生長48 h，從定植后12～48 h，細菌定植點到功能血管的距離從1.30×10-4m增長到了3.10×10-4m，48 h后細菌從腫瘤邊緣向腫瘤中心移動并誘導腫瘤細胞凋亡，96 h后細菌出現腫瘤過渡區，所有觀察到的轉移腫瘤組織中44%都發現了沙門菌，而正常肝組織中只有0.5%，證明沙門細菌可以滲透進入腫瘤組織并且可以選擇性地定植到轉移瘤組織。

1.2 傷寒沙門菌不同菌株抗腫瘤的研究介紹

1.2.1 VNP20009 的抗腫瘤作用研究 VNP20009［8］是傷寒沙門菌的減毒菌株，剔除了毒性基因msbB和purI后完全減毒(防止宿主中毒性休克)并依賴外源性嘌呤生存，這種依賴致使其在正常組織中不能復制，而在可以提供嘌呤的腫瘤組織中可以生長繁殖，具有抗生素敏感性，遺傳穩定，這種細菌載體體外及動物實驗表現出對長久的廣譜抗腫瘤作用，甚至可以到轉移瘤中定植［9］。VNP20009抗腫瘤Ⅰ期臨床試驗顯示［10］，VNP20009是安全的，但無明顯的抗腫瘤效果，VNP20009在濃度達3×108CFU/m2時實驗動物未出現不良反應，在部分腫瘤組織內存在細菌聚集現象，減毒沙門菌VNP20009治療腫瘤的臨床試驗引起的腫瘤壞死因子α比外周血中少1000倍，原因可能是過度的減低細菌毒性使得不僅不能誘導腫瘤壞死因子α產生，也不能誘導有效的炎性反應。

1.2.2 新型傷寒沙門菌抗腫瘤的研究 Hoffman［11］在實驗室培育的亮氨酸缺陷型傷寒沙門菌被證實是一種對活的癌組織有效的細菌，對腫瘤組織有很高的毒力，在體外，A1-R突變株可以人感染腫瘤細胞導致細胞核碎裂。A1-R突變株開始用來治療轉移性前列腺癌和乳腺癌的裸鼠模型，40%的裸鼠被完全治愈，與對照組裸鼠生存時間一樣長。靜脈注射A1-R突變株對骨肉瘤肺轉移的裸鼠模型有很高的療效，尤其是對轉移瘤療效更好。A1-R突變株還可以通過淋巴途徑定植于裸鼠人類胰腺癌模型和纖維肉瘤模型在腋窩和腘窩處淋巴結的腫瘤轉移灶，也可以通過尾靜脈注射定植到裸鼠纖維肉瘤的肺轉移灶。轉移瘤被治愈不需要化療或其他治療方法輔助。A1-R突變株被注射入裸鼠原位胰腺癌模型中，胰腺腫瘤消退同樣不需要化療等其他療法輔助。當A1-R突變株在脾內注射對裸鼠胰腺癌肝轉移同樣有效。細菌單一療法有效治療原發性及轉移性腫瘤相比以前的需要化療藥物輔助的細菌療法有很大進步，三個啟動子克隆被確定有利于細菌在腫瘤組織而不是在脾等其他正常組織生長。

1.2.3 基因工程改造的傷寒沙門菌抗腫瘤的研究關于沙門菌還有其他一些嘗試取得了有希望的結果［12-14］，一種基因改造的精氨酸和亮氨酸營養缺陷性沙門菌在多個研究中表現出強烈的腫瘤組織定植特點，而在肝臟和脾臟中很快清除，這種細菌還表現出在多種腫瘤壞死組織和存活腫瘤組織中都能定植并引起腫瘤萎縮壞死。

重組嘧啶脫氨基酶的傷寒沙門菌［15］(attenuated S.Typhimurium engineered to express CDase，TAPET-CD)把大腸埃希菌嘧啶脫氨基酶基因轉導入VNP20009的菌株，同樣可以特異地定植到腫瘤組織中并繁殖，而且可以在腫瘤組織局部把無毒的氟尿嘧啶前體通過脫氨基作用轉化為有細胞毒性作用的氟尿嘧啶，從而減小了氟尿嘧啶的全身毒性，提高了腫瘤局部的藥物濃度，強化了抗腫瘤作用，而對腫瘤周圍正常組織毒性大大減小。19F磁共振波譜分析顯示了小鼠體內注射TAPET-CD后可以把氟尿嘧啶前體轉化為氟尿嘧啶，氟尿嘧啶在腫瘤組織中濃度更高，濃度維持時間更長，導致腫瘤體積比單獨用氟尿嘧啶或TAPET-CD注射明顯減少。在三個晚期癌癥患者的小規模實驗［16］中，瘤內注射TAPET-CD證實是安全的，其中兩個患者注射后細菌定植保持了15 d，患者也應用了氟尿嘧啶前體，證實可以轉化為氟尿嘧啶，這兩個患者的病情沒有再惡化。這些前期實驗說明了利用細菌攜帶功能基因在腫瘤組織把有效藥物前體轉化抗癌藥物的可行性。另有研究［17］報道，TAPET-CD的抗腫瘤作用與細菌定植和嘧啶脫氨基酶表達沒有明顯關系，腫瘤生長延遲原因是酶的活動而不是嘧啶脫氨基酶的表達。

目前活的減毒細菌作為抗腫瘤的直接作用者和基因控制的前體藥物酶療法顯示出是可能的治療策略，VNP20009和TAPET-CD成功進行Ⅰ期臨床實驗，嵌合的毒素也在細菌毒素抗腫瘤的研究當中，一種cya/crp(調節AMP水平的基因編碼蛋白)突變的沙門菌被基因工程改造后表達白細胞介素2用于肝癌治療的研究也在進行中。

2 銅綠假單胞菌

2.1 銅綠假單胞菌介紹 銅綠假單胞菌是臨床上較常見的條件致病菌之一。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)制劑是以普通銅綠假單胞菌為載體表達甘露糖敏感性菌毛的滅活制劑，是一種新型的廣譜免疫調節劑，除了能作為大分子抗原刺激機體，全面提高和調節人體的體液免疫和細胞免疫功能外，其菌毛還能特異性地與高甘露糖表達型的腫瘤細胞結合，改變腫瘤細胞膜的結構和功能，使細胞生物學行為改變。PA的不良反應極低，因此已被臨床用于感染、腫瘤及免疫相關疾病等的治療，并取得一定的療效［18］。

2.2 PA體外實驗對人腫瘤細胞的作用研究 劉巖等［19］測定了銅綠假單胞菌-甘露糖敏感性血凝菌毛株菌疫苗(Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hamemagglutination vaccine，PA-MSHA)對 HepG-2 細胞增殖的抑制作用，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)結果表明，PA-MSHA對HepG-2細胞的增殖有抑制作用，且抑制程度與藥物濃度和時間呈正比，具有時間-劑量依賴關系;Western blot檢測結果顯示PA-MSHA作用后，Bax、caspase-3蛋白表達上調，上調的程度隨PA-MSHA濃度的增加而提高;Bcl-2蛋白表達下調，下調的程度隨PA-MSHA濃度的增加而加大;細胞超微結構觀察實驗組符合細胞凋亡的特征。PA-MSHA處理12 h組：細胞器變性，細胞內出現較多空泡，細胞核輕度固縮，部分細胞線粒體可見空泡變，異染色質凝集成塊。PA-MSHA處理24 h組：大部分細胞出現小泡，細胞核輕度固縮，細胞器變性;少部分核固縮明顯，胞體固縮，細胞器減少。PA-MSHA處理48 h組：大部分形成凋亡小體，細胞器明顯減少核固縮明顯，細胞突起減少。本實驗結果表明，高濃度組PA-MSHA可明顯抑制裸鼠腫瘤的大小，腫瘤大小由1.70 cm3降到 0.68 cm3，抑瘤率達到60%，說明PA-MSHA于腫瘤局部注射時具有明顯的抑瘤效果。在實驗過程中，實驗組小鼠狀態良好，無明顯不良反應，說明PA-MSHA，體內注射具有安全性。其具體的機制仍在研究中，一種從銅綠假單胞菌外膜蛋白來源的疫苗表現出免疫調節能力，一種失活的甘露糖敏感性紅血球凝集菌毛的銅綠假單胞菌突變系(PA-MSHA)已經作為惡性腫瘤的輔助療法來應用。

周建煒等［20］研究證實，PA明顯抑制人肝癌細胞株MHCC97L細胞增殖和克隆形成，呈良好的劑量-效應關系。PA 48 h和72 h的半數抑制濃度分別為3.1×1011/L 和1.9×1011/L。PA 濃度為0.5 ×1011、1×1011、2×1011/L時，其細胞倍增時間依次增加，克隆形成率依次降低，表明在一定條件下，PA可抑制人肝癌MHCC97L細胞增殖和克隆形成，其作用部分是通過使細胞周期阻滯在G1期實現的;PA可以明顯抑制MHCC97L細胞的侵襲、運動和遷移能力，其作用與血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶2蛋白分泌關系不明顯。

在Cao等［21］的研究中，人肝癌細胞系HepG-2和BEL-7402腫瘤細胞的生長都被PA-MSHA抑制了，但不是被甘露糖鈍化的PA-MSHA，PA-MSHA處理過的細胞停滯在細胞周期的S期并凋亡。作者假定HepG-2和BEL-7402腫瘤細胞的凋亡是由PA-MSHA的甘露糖殘留物介導的，并直接通過caspase-8，外在凋亡途徑引發。

免疫抗癌療法必需的有效T細胞反應是由抗原呈遞細胞啟動的，多個研究評估了多種抗原呈遞方式的有效性，包括細菌載體。理想的載體應包括低毒性和穩定的N端終止序列，可以把混合抗原轉導入細胞，活的經過基因工程處理的銅綠假單胞菌用來運載重組的抗原蛋白通過Ⅲ型分泌系統進入哺乳類動物細胞內，即一個把效應蛋白轉導入宿主細胞的細菌載體。在體外銅綠假單胞菌載體轉導卵清蛋白片段到樹突狀細胞引起了卵清蛋白特異性的CD+T8細胞激活［22］，接受卵清蛋白注射的小鼠產生了卵清蛋白特異性CD8+T細胞，表現出對卵清蛋白過度表達黑素瘤的抵抗。還有在治療效果檢驗中，于腫瘤模型建立5～12 d注射銅綠假單胞菌載體，6個實驗動物有5個獲得完全治愈。這些結果點燃了以Ⅲ型分泌系統為基礎的載體在免疫療法抗腫瘤應用中的希望。另有文獻報道白細胞介素4與銅綠假單胞菌外毒素的融合毒素正在進行惡性膠質瘤患者的Ⅰ期臨床實驗。

3 存在問題

安全性問題仍然是細菌抗腫瘤療法的首要問題，雖然大多數報道證實細菌制劑是安全的，但是控制活體細菌的毒性、減少不良反應還要進一步研究評估測試，另有報道［23］，細菌抗腫瘤研究中系統感染仍然存在，即使剔除毒性基因像在COBALT療法中，仍有15%～45%的實驗動物小鼠死亡;其次是不完全的腫瘤細胞死亡，細菌并不引起完全的腫瘤組織細胞壞死，必須聯合應用化療或進一步研究;第三是在壞死缺氧的腫瘤組織生長繁殖的細菌對無壞死的轉移性腫瘤病灶作用效果不佳，而轉移灶常常是因腫瘤致死的元兇，由于這些轉移灶很小，細菌定植困難，細菌難以完全浸潤腫瘤組織，因此可能需要腫瘤內注射［24］，其他的涉及細菌療法的問題［25］還包括潛在的基因突變，因突變導致抗腫瘤功能喪失或導致多種問題如治療失敗、感染加重等。

4 結語

目前關于細菌抗癌的研究還處于實驗研究階段，其他的菌種如雙歧桿菌、減毒李斯特菌等菌株和多種腫瘤細胞株，多種荷瘤實驗動物模型也正在研究中，得出的結論多是肯定的，細菌可促進腫瘤細胞凋亡，部分研究的結論甚至是治愈惡性腫瘤，其結果是在體外細胞培養或實驗動物(如荷瘤裸鼠)身上取得的，進一步的臨床實驗大多還沒有開展，具體的生化免疫機制仍需要進一步探索。

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The Study of Antitumor Effects of Bacteria

YANG Xu-guang，YANG Zhi-qi，SUN Zhen-gang.(Department of Hepatobiliary Surgery，Jingzhou Clinical Medicine School Affiliated to Yangtze University，Jingzhou434020，China)

The resistance of malignant tumors to traditional antitumor therapies pushes the search for new and more effective antitumor therapies.Studies reveal that some types of bacteria can suppress tumor cell growth or kill tumor cells，and some other types have the ability of assembling in tumor tissue，thus can be used as vectors for antitumor drugs and genes;bacteria toxins also show antitumor effects，some types of bacteria have gone through phase Ⅰ clinical trials，while the relationship between bacteria，including pathogenic bacteria，and tumors still needs further medical study.

Antitumor;Salmonella typhi;Pseudomonas aeruginosa;Bacterial agent;Biotherapy

Q782;Q935

A

1006-2084(2012)13-2001-04

2012-02-22

2012-05-15 編輯：紀燕飛