小鼠模型在甲狀腺癌研究中的應用進展

鄭永勝(綜述)，蘇國強(審校)

(福建醫科大學第一臨床醫學院，廈門大學附屬第一醫院普外科，福建廈門 361003)

小鼠模型在甲狀腺癌研究中的應用進展

鄭永勝△(綜述)，蘇國強※(審校)

(福建醫科大學第一臨床醫學院，廈門大學附屬第一醫院普外科，福建廈門 361003)

甲狀腺癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，我國近年甲狀腺癌的發病率呈逐年上升趨勢。小鼠動物模型在研究甲狀腺癌的發生、發展及藥物治療中發揮著重要作用，目前用于甲狀腺癌研究的主要小鼠模型包括自發性小鼠模型、誘發性小鼠模型、基因工程小鼠模型、移植性小鼠模型和最新報道的在特定時間和特定組織激活或滅活靶基因的限制性小鼠模型。

甲狀腺癌;小鼠模型;動物實驗

甲狀腺癌占所有實體腫瘤的1%，是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，也是近年發生率上升最快的惡性腫瘤之一［1］。甲狀腺癌動物實驗的研究已經多年的歷史，理想的動物模型應該真實地反映人類甲狀腺癌的發病機制、腫瘤對人體侵害引起的生物化學變化、生物學行為和形態學的改變及對實驗藥物療效的一致性等。2002年小鼠基因組的測序工作證實小鼠與人類基因相似，且在生理學、生物學許多特性方面也極其相似，是腫瘤研究的理想動物模型。而且目前的技術能夠在鼠的基因水平上設計與人類疾病相關的基因突變而獲得相關疾病模型［2］。小鼠模型是目前可以整合基礎和臨床腫瘤研究的武器，已應用于腫瘤研究的各個領域。在甲狀腺癌研究中，目前已經建立了一些小鼠實驗模型，能近似地模擬甲狀腺癌的某些特征，但是不能完全模擬人類甲狀腺癌的全部特征，因此，應根據研究的需要來選擇不同的動物模型，達到最好的研究效果。

1 自發性腫瘤模型

自發性腫瘤模型是近交系腫瘤疾病模型，是最早被報道的動物模型，自發腫瘤小鼠在自然情況下產生腫瘤，未經任何有意識的人工處理，腫瘤的發生、發展與人類腫瘤很相似，具有很高的價值。近年來十分重視對自發的動物疾病模型的研發，以發現自發性疾病的病例，而后通過遺傳育種，將這種自發性疾病模型保持下來，并培育成具有特定遺傳性狀的突變系，以供研究。

選用自發性腫瘤模型的優點有以下幾個方面：①自發性腫瘤通常比用實驗方法誘發的腫瘤與人類所患的腫瘤更為相似，有利于動物實驗結果反推用到人;②這一類腫瘤發生的條件比較自然，有可能通過細致的觀察和統計分析而發現原來沒有發現的環境因素或其他的致癌因素，可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發生上的作用［3］。由于小鼠自發甲狀腺癌的發生率極低，難以獲得并應用于甲狀腺癌的研究，盡管使用近交系小鼠增加了甲狀腺癌的發生率，仍不能很好地實現實驗的可預測性和可重復性。

2 誘發性腫瘤模型

誘發性腫瘤模型是通過使用物理、化學和生物的致病因素作用于動物，造成動物組織、器官或全身一定的損害，出現某些類似人類腫瘤的功能、代謝改變，如用化學致癌劑、放射線、致癌病毒誘發動物的腫瘤。1960年Israel等［4］為觀察甲狀腺癌的潛在發生率，分別用空白組、丙硫氧嘧啶組和無碘飲食組三組小鼠甲狀腺癌模型，最終丙硫氧嘧啶組和無碘飲食組成功誘導小鼠甲狀腺癌。2011年Lieberman等［5］利用放射核素誘發小鼠腫瘤等實驗中甲狀腺癌發生率排第3位。

誘發性腫瘤模型具有能在短時間內復制出大量疾病模型，并能嚴格控制各種條件使復制出的腫瘤模型適合研究目的需要等特點，因而為近代醫藥研究所常用。但難以觀察腫瘤的動態發生、發展，常缺乏客觀測量腫瘤發生、發展或退縮的指標，且誘發模型和自然產生的腫瘤模型在某些方面畢竟存在一些差異，因此設計誘發性腫瘤模型要盡量克服其不足，發揮其特點。

3 基因工程小鼠模型

人為地運用各種生物技術手段有目的地干擾小鼠的基因，導致小鼠新的性狀的出現并能夠有效地遺傳下去，形成新的可供生命醫藥所需要的腫瘤模型，稱基因工程小鼠模型。包括轉基因模型、基因剔除模型、基因替換模型及最新報道的限制性小鼠模型。

3.1 轉基因小鼠模型 Gordon等［6］在20世紀80年代發現了轉基因小鼠技術。轉基因小鼠是指通過不同的方法將外源基因導入小鼠受精卵，然后產生攜帶外源基因的小鼠品系，并能通過生殖細胞將外源基因傳遞給后代的小鼠。2009年Diallo-Krou等［7］利用轉基因小鼠觀察成對第8基因過氧化物酶體增殖活化受體和磷酸酶、張力蛋白沉默協同對甲狀腺癌癌組織生長的影響。2011年Lee等［8］利用轉基因小鼠模型觀察BRAFV600E激酶和蛋白激酶MST1途徑在甲狀腺癌發生過程中的關系。轉基因小鼠模型已廣泛應用于腫瘤的發生機制、免疫耐受性、胚胎發育、基因治療等方面研究。目前轉基因技術主要有顯微原核注射法、反轉錄病毒感染法、胚胎肝細胞介導法、體細胞核移植技術、精子載體法、胞質內單精子注射法和卵母細胞載體法等［9］。

轉基因小鼠的產生有助于人們理解化學藥物和腫瘤基因相互作用的機制，成為研究甲狀腺癌發生機制的有力手段。隨著新的腫瘤基因和腫瘤抑制基因的發現以及一些新技術的引入，例如，用于轉基因的可控表達系統，基因定位剔除技術等，會使轉基因小鼠技術進一步完善，小鼠腫瘤模型更加接近實際情況，更有力地揭示甲狀腺癌的發生機制。

3.2 基因剔除小鼠模型 基因剔除［10］20世紀是80年代后半期應用DNA同源重組原理發展起來的一門新的技術，是指借助分子生物學、細胞生物學和動物胚胎學的方法，通過胚胎肝細胞這一特殊的中間環節將模式生物正常的功能基因的編碼區破壞，使特定基因失活，以研究該基因的功能，或者通過外源基因來替換宿主基因組中的相應部分，以便測定它們是否具有相同的功能，或者將正?；蛞胨拗骰蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。1989年 Thompson等［11］通過基于 ES細胞囊胚注射的基因剔除，建立了次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因被定點剔除的小鼠模型。Fedele等［12］利用基因剔除小鼠模型研究p27kip1功能沉默對甲狀腺癌的影響。該模型的建立為腫瘤的診斷和治療提供了很好的靶子。通過對該模型的研究，許多與甲狀腺癌相關的新基因的功能得到闡明，從而導致抗腫瘤領域中許多突破性進展。

3.3 基因替換小鼠模型 基因替換是將有功能的正?；蜣D移到疾病細胞中，通過替換病變細胞內的致病基因，或整合到基因組的某一位點或獨立于基因組之外表達，以替代缺陷基因發揮作用?；虻耐蛔兓蛉笔悄[瘤發生的重要原因，這些基因包括抑癌基因(如 p53，Rb)，促凋亡基因(如 bax，caspases)以及一些細胞周期調控基因等。把上述正?；驅肽[瘤細胞內，將有可能逆轉由于相應基因突變導致的惡性表型。2010年Randall等［13］利用基因小鼠替換模型研究活化炭疽致死毒素抑制未分化型甲狀腺癌癌組織血管金屬激酶。雖然基因小鼠替換模型現在仍不是很成熟，但有望成為甲狀腺癌基因治療研究方向重要的模型。

3.4 限制性小鼠模型 限制性小鼠模型是指在某些特定條件下利用生物工程技術的小鼠甲狀腺癌模型。Ouyang等［14］利用小鼠模型成功的觀察了RET/PTC或BRAF基因突變的甲狀腺癌細胞在Raf激酶活性抑制下生長受阻。限制性小鼠模型能很好地模擬人甲狀腺癌，且能觀察在特定條件下的腫瘤變化，有利于對腫瘤基因的研究。

基因工程小鼠模型可按照研究目的進行設計和培育，其建立過程的本身就可進行疾病機制的研究。不但能從小鼠整體水平和組織器官水平上進行研究，而且還可以深入到細胞水平和分子水平，為發病機制、藥物篩選和臨床醫藥研究提供比較理想的實驗體系。轉基因技術克服了物種見的生殖隔離，實現了動物物種之間遺傳物質的交換和重組。從理論上講，隨著基因工程的發展，已可能在體外培育小鼠細胞中對任何一個或幾個已知基因組結構和DNA序列的位點進行各種類型的遺傳修飾。但是基因調控機制十分復雜，目前基因工程模型提供的信息還很局限，如導入一個癌基因可能激活另一個癌基因，從而導致了特異性腫瘤的發生。

4 移植性小鼠模型

移植性小鼠模型是指將腫瘤到小鼠身上使其生長發育，是建立腫瘤模型的另一種重要的方法。2010年張富海等［15］在裸鼠兩髖外側皮下接種甲狀腺癌細胞后，觀察核因子κB抑制劑與多烯紫杉醇聯合治療下甲狀腺癌瘤體增長情況。目前移植性腫瘤動物模型所遇到的困難是移植物受到宿主免疫排除、生長緩慢、不能穩定長期傳代和不便于觀察。

4.1 免疫缺陷小鼠 由于裸小鼠和嚴重聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的應用，人類的腫瘤在受體小鼠內的異種移植得到實現，而不受到移植排斥。1962年Grist在非近交小鼠中發現了無毛小鼠，1966年Flanagan將其命名為裸鼠，1968年 Pantelouris等［16］發現，這種動物為無毛、無胸腺動物。1969年，Rygaard等［17］成功地將人結腸癌細胞移植于裸鼠，建立了人腫瘤異位移植模型。20世紀70年代初，Giovanella等［18］報道，一些體外培養的人癌細胞系也相繼成功地移植于裸鼠，從而在人體外建立起了人體腫瘤的整體研究體系。裸小鼠11號染色體上的隱形裸基因突變而無被毛，先天性無胸腺或僅有異常的胸腺上皮，不能分泌胸腺素使T細胞正常分化，細胞免疫力低下［19］。SCID小鼠在1983首先發現于C.B-17的同源近交系，是第16號染色體上稱scid的單個隱形基因所致，SCID是CB-17/IcrJ的同源近交系。SCID小鼠的所有T和B淋巴細胞功能測試均為陰性，對外源性抗原無細胞免疫及抗體反應，體內缺乏攜帶前B細胞、B細胞和T細胞表面標志的細胞。但是，其非淋巴性造血細胞分化不受突變基因的影響，巨噬細胞、粒細胞、巨核細胞、紅細胞等呈現正常狀態，自然殺傷細胞及淋巴因子激活細胞也呈正常狀態，對人類的移植物能產生排斥反應，是腫瘤研究的理想動物模型。隨著分子生物學的發展及基因工程技術的進步，通過轉基因技術將腫瘤相關基因轉入小鼠的基因中，產生特定的腫瘤動物模型;或者將腫瘤相關基因剔除，研究腫瘤與相關基因的關系。

4.2 移植的材料 移植的腫瘤來源包括裸鼠體內的移植甲狀腺瘤、手術切除的人類甲狀腺癌組織、人甲狀腺癌細胞株等。腫瘤的來源、性質對移植的成功率有明顯的影響，應用轉移腫瘤組織作為移植物，其成功率高于原發腫瘤組織，轉移率也較高;經傳代培養或篩選過的高轉移人癌細胞移植成功率和轉移率都較高。用腫瘤組織塊做移植物的優點在于腫瘤組織生長的微環境和原發腫瘤生長的微環境相近，缺點是不同的腫瘤甚至在同個腫瘤中所取的腫瘤組織存在異質性，使得實驗缺少統一性和對比性，同時，人類腫瘤組織經常含有壞死區，影響移植后腫瘤的生長。

4.3 移植的方法及部位 移植的方法和部位有很多種，移植的部位包括：皮下、腹腔、靜脈、原位移植。最簡單甲狀腺癌的小鼠移植主要有兩種方法，最常用的一種方法是皮下注射，皮下注射方便觀察腫瘤的生長情況，并且能夠評估給予治療藥后的效果，但是，由于皮下注射腫瘤生長的微環境和原位生長的腫瘤的微環境有差別，腫瘤具有不同的特征，比如生長因子的水平、營養素和腫瘤的血管發生、轉移的行為等。另一種是原位移植，能較真實地反映腫瘤的生長、轉移及侵襲情況，然而，小鼠甲狀腺組織細小，原位操作上比較困難，移植物只能是細胞懸液。應用人甲狀腺癌細胞作移植物時，有時需篩選出高轉移癌系細胞，方法有將腫瘤細胞進行體外培養，選出轉移性高的細胞亞群;在轉移灶體內連續傳代癌細胞，使具轉移能力細胞亞群升高;將癌細胞與興趣靶器官組織共同孵育，提高癌細胞和靶器官的親和性;利用克隆技術，建立細胞株，產生較多含具有轉移能力的干細胞。孫輝等［20］在2002年建立了人甲狀腺未分化癌細胞系TA-K裸鼠原位移植模型，觀察移植后腫瘤生長情況和轉移規律。

4.4 移植性小鼠模型的應用及優缺點 移植腫瘤復制簡單，生物學特性較穩定，實驗的重復性好，實驗結果可靠。能保存較長時間而特性不變，可以連續移植，長期供實驗用。實驗周期短，實驗中花費的人力、物力較少，實驗結果能較好地外推到人。但是由于不能完全模擬人類腫瘤的各種生物性特征，與人體自發腫瘤相比較移植性腫瘤生長速度快，核型固定，增殖比率高，倍增時間短。

5 小結

綜上所述，小鼠甲狀腺癌模型的研究，特別是利用分子生物學、基因工程等建立的各種小鼠模型，將是甲狀腺癌研究的重要內容。隨著各種技術的發展，人們將會逐漸了解甲狀腺癌的發病機制、侵襲及轉移過程等，從而找到治療甲狀腺癌的有效方法。由于各種甲狀腺癌小鼠模型均不能完全模擬人類甲狀腺癌的全部特征，因此，應根據研究的需要來選擇不同的動物模型，達到最好的研究效果。

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Advances on Mouse Models Application in Thyroid Cancer Research

ZHENG Yong-sheng，SU Guoqiang.(Fujian Medical University First Clinical College，General Surgery Department of the First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen361003，China)

Thyroid cancer is the most common malignant thyroid tumor.In recent years，the incidence of thyroid cancer is in an uptrend year by year in China.The experiments on mice have played an important role in studying the occurrence，development and drug therapy of thyroid cancer.Presently the major mouse model being used in studying thyroid cancer includes spontaneous，suppressive，genetic，transplanted and restricted mouse model reported recently activating or inactivating genes at a particular time and tissue.

Thyroid cancer;Mouse model;Animal experiment

R736.1

A

1006-2084(2012)13-2016-04

2011-11-21

2012-02-16 編輯：樓立理