角膜上皮組織工程學研究及臨床應用新進展

王威 張紅 劉平

角膜組織工程學是現代角膜疾病基礎學研究的重要方法之一，角膜上皮細胞的體外培養更是研究角膜的生理學、病理學、免疫學、分子生物學以及臨床應用極為重要的手段?，F將近年來國內外角膜上皮細胞組織工程學發展現狀及其在眼科臨床應用中的進展作一綜述。

1 角膜上皮的構建

1.1 種子細胞的選擇 角膜上皮具有自我更新的能力，它是由位于角膜緣的干細胞增殖分化而來的。1986年Schermer等最先實驗證明角膜上皮干細胞存在于角膜緣基底層的Vogt柵欄處;Tsubota等最早行異體角膜移植術;Pellegrini等［1］首次通過體外擴增角膜緣干細胞進行眼表重建，成為角膜緣干細胞移植發展史上的里程碑。在穿透性角膜移植的同期或分期聯合施行角膜緣干細胞移植是目前最理想的移植術，尤其適合于角膜緣干細胞嚴重缺乏的病例。它彌補了當前角膜移植術只能取代混濁的角膜基質或失代償的角膜內皮，不能迅速上皮化，不能阻止新生血管侵入、排斥反應重、手術失敗率高的缺陷。因其在培養過程中所需角膜緣組織極少，對供眼無潛在威脅;培養的細胞可凍存，可用于二次手術;能抑制眼表急性病變發展，迅速恢復術眼正常的眼表結構;免疫原性低，符合人的自身發展狀況，成為角膜上皮組織工程重建中最理想的種子細胞。目前研究中爭論的焦點主要集中在角膜緣干細胞的特異標記物還不能明確［2］，沒辦法闡明角膜緣干細胞怎樣進行分裂及定位，在臨床試驗中不能大量提純與增殖等。因此國內外學者不斷嘗試開發各種細胞、組織，通過各種方法經體外誘導分化為種子資源，在解決種子細胞來源匱乏及移植排斥問題上顯示了誘人的前景。如取自周圍血、臍帶血、骨髓中的干細胞［3］;來源于早期胚胎原始生殖嵴具有無限增殖能力的胚胎干細胞［4-5］及胚胎皮膚干細胞［6］;發育同源性的口腔黏膜皮膚上皮細胞［7-9］;另外還有結膜干細胞［10］、間質干細胞［11-12］、牙髓干細胞［13］、毛囊干細胞［14］等，它們或因取材方便，或因體外增殖能力強，或因能表達角膜特異性標記物等吸引眼科學者不斷進行探索，但也因機械性能差，不能逾越的安全性、倫理性問題，以及僅能形成類角膜上皮樣組織等方面的不足而不能在臨床工作中大量開展應用。

1.2 支架材料選擇 當前組織工程中的生物材料仍以天然材料、人工合成材料、復合材料為主。羊膜在眼科應用的最早、范圍最廣，現在已經能根據不同需要制備不同的羊膜，通過不斷的改進，已能克服制備不標準，細胞生長緩慢、不均勻、易脫落，易感染HIV、肝炎，體外培養易發生“去分化”等缺點［15］。膠原是天然細胞外基質的重要組成部分，通過交聯、非醛交聯及應用溶酶體酶技術對膠原進行改進，控制其密度、交聯方式、孔隙率，改善降解速率，加強其強度與韌性，是支架材料很好的選擇之一［16］;除去了脂質膜、膜相關抗原和可溶性蛋白質的脫細胞角膜基質，免疫原性更低，同時又保持了天然角膜板層纖維結構、韌性、厚度的特點，其超微環境更適于細胞再生與三維重建，還能使不可利用的基質得到重新應用;纖維凝膠是細胞外基質的多功能成分，具有可以從人及牛血液中制備，提取更方便，來源更豐富［17］的優點;生物蛋白膜蠶絲蛋白的應用是目前研究開發的熱點［18］;改進人工支架材料聚乳酸、多聚已酸［19-20］的代謝及滲透壓等都是目前聚焦的研究方向。各種生物材料在介導細胞附著、生長，促進細胞增殖，減少細胞凋亡，聯合生物活性分子及生長因子，保留天然高分子聚合物，表達二維和三維空間結構，改善代謝及滲透壓，降低細胞毒性，操作方便等方面都有不斷的突破與改進，但它們也有各自不同的缺點及不足。2004年，Nishida等［9］利用簡單的溫度變化，在無胰酶消化的情況下使細胞膜片脫落，培養的角膜上皮細胞免疫組織學檢測及免疫印跡檢測顯示角膜上皮樣特征，細胞間連接與膜片透明性良好。收獲的細胞膜片易于移植操作，與角膜基質黏附緊密，無需縫合。并且易對密度、厚度、添加成分等進行掌控，影響細胞的黏附與增殖。避免了傳統組織工程中使用胰酶消化或機械刮取對培養角膜細胞完整性的破壞及載體材料對組織修復的影響，此即無載體培養。這為組織工程支架材料的應用帶來了新的應用前景?？傊?，支架材料無毒副作用、組織相容性好、生物可降解性佳，具有一定的機械強度，是組織工程支架材料的研究方向。

2 微環境的調控

干細胞微環境學說最先由Schofield提出，學說假設基底部Vogt柵欄內的乳頭狀結構深入到基底深層，與血管網接觸，吸收營養［21］;基質細胞中分泌多種細胞因子和生長因子，誘發人類組織相容性D抗原輔助T淋巴細胞反應(HLA-D/Th)［21］，使干細胞在機體特殊的內環境作用下保持未分化或分化狀態動態平衡，調節細胞的有絲分裂與凋亡，促進上皮細胞分化與遷移，延長干細胞的存活壽命。體外研究表明很多細胞因子及生長因子都能上調干細胞的增殖、遷移與分化、促進p63高表達，如腫瘤生長因子(TGF)、白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、增益因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)［22］等。因此基因治療應運而生，即通過特定的分子生物學技術關閉或降低異?；虻谋磉_或將正常的外源基因導入體內特定的靶細胞以彌補缺陷基因，或將某種特定基因導入體細胞內，反義寡核苷酸阻斷RNA的轉錄等以產生特定的蛋白質因子表達，從而實現對疾病的治療作用，使細胞進入不同的形態或未分化狀態［23］，調節干細胞的增殖，促進上皮細胞化。

3 培養方法

角膜上皮細胞體外培養方法中，細胞懸液法能裂解信號，誘導干細胞表達更多角蛋白K3和K12，似乎更適于細胞生長，但尚無完整的統計學資料進行證明。以往在組織培養過程中常添加各種成分，如3T3鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3)、胎牛血清、小牛血清等，在促進細胞增殖的同時，也增加了感染與污染的危險。采用無血清、氣液平面培養，盡量模擬體內生長環境，同時在組織工程制備過程中要求具有“干凈”的實驗室，優良、規范化的制作程序，臨床實驗要求符合法國管理條約(AFSSaPS)和法國健康組織與歐盟指導原則。試驗方法要遵照赫爾辛基宣言與人類組織國際道德倫理規范。終極目標是減少成纖維污染，保護干細胞在培養過程中的生存環境，以確?；颊咴谥委熯^程中的安全性及臨床試驗與實驗研究可靠性。

4 術后防治措施

免疫抑制劑在異體角膜移植甚至在自體角膜移植中的應用都有很成熟的報道［24］，臨床術后常單獨或聯合應用的免疫抑制劑有:環胞霉素、環磷酰胺、糖皮質激素［25］，應用后9個月就很難在上皮中找到DNA、HLA-DR抗原和淋巴細胞。術后并發的炎癥、滲出、穿孔、青光眼等常與細胞培養方式過程中的許多復雜而未知的因素有關。因此術后采用一系列防護措施，如繃帶式接觸鏡、眼瞼縫合、羊膜縫合等技術能促進角膜上皮化，提高手術成功率，減少角膜上皮的溶解與排斥。以往臨床普遍采用術后6個月的隨訪時間，但完全角膜上皮化需要9～12個月的時間，移植失敗一般發生在2 a左右，因此采用24個月術后隨訪時間更合理，以便能更好地評估細胞治療的安全性與有效性。HLA基因配型可以從根本上防治異體移植排斥反應的發生。隨著科學技術的發展、基因敲除技術的完善，移植免疫排斥的問題將會被徹底解決。

5 眼表評估

因為不同的研究者采用不同培養方法及實驗過程進行研究，樣本采集數量等也不同，導致評價指標及結果有很大差異，從而影響結果的分析與判斷。在嚴重的眼表疾病，常伴有結膜與眼瞼的病理學改變，術前要給予恰當而準確的評估，對選擇不同的治療方案，估計預后及指導臨床治療具有重要意義。目前國際上公認應在術前應用印跡細胞學、共聚焦顯微鏡、熒光染色、照片法及裂隙燈等方法，以最小的侵襲力對眼附屬器如眼瞼、睫毛、結膜、淚膜、穹隆深度、角膜瘢痕、新生血管、干眼癥等方面進行評估。并給予如板層角膜移植、結膜移植等恰當的術前治療以增加術后成功率。手術后僅單純采用視敏度進行評估，由于主觀原因使評估結果可靠度差，采用Snellen評分，術后大約能提高＞2 Snellen視敏度。并用X+Y=Z方程式來評價細胞生成與丟失的關系(X代表基底細胞向角膜中央遷徙，Y代表周圍細胞向中央遷徙，Z代表剝脫的角膜上皮)［25］及細胞生長曲線都是對角膜細胞生長有效的評估。問卷調查患者的生活質量也應被考慮在術后評估的范疇內。據報道在體外培養的角膜緣干細胞中如有3%的p63染色陽性，臨床就能使接受移植的患者達到78%的成功率［26］。這也說明移植成功的關鍵取決于干細胞在培養過程中的充足性。目前完整的評價標準還是很難達到統一。但在一些西歐國家，是由人類組織權利機構等對診斷、材料的來源、培養方式、手術及術后護理進行系統規范管理的。

6 問題與展望

組織工程技術是應用細胞生物學和工程學原理，研究開發制作用于修復、改善損傷組織結構和功能替代物的一門技術。其方法是取少量自體組織的某種細胞，在體外培養、擴增后，將其接種到支架材料上生長，再將此細胞支架復合物植入體內或缺損部位，種植的細胞繼續增殖，形成新的組織和器官，達到修復缺損和重建功能的目的。組織工程技術自20世紀80年代興起以來，迅速成為材料科學及生物醫學領域的熱點。角膜因其無血管透明，被稱為“免疫赦免區”，在組織工程中具有重要的意義與地位。角膜組織工程與再生醫學的目的不僅是要替換受損和功能障礙的組織，還要恢復有用視力，而只替換一層角膜病變組織以達到治療的效果是最理想的治療方法，因此角膜上皮重建對角膜組織的重建與再生具有重要意義。我國角膜組織工程學起步于1994年，建立穩定的角膜種子細胞體外培養體系，成功分離、培養，獲取培養期更長、傳代數更多、遺傳特性更穩定的種子細胞，開發研制新的支架材料，替代功能不良與衰竭的角膜上皮組織，治療不可逆的疾病與損傷，恢復健康的眼表及視功能，使患者不必經歷反復手術，終生應用免疫抑制劑的痛苦，并創建具有自主產權的生物產品應用于臨床一直是我國組織工程研究者奮斗的目標。因此我們必需真正懂得角膜組織工程相關因素發生發展的機制，進一步認識其真正的潛能，才能增加植片存活率。盡管在目前的研究與應用中還存在這樣那樣的問題，但不可否認的是角膜組織工程重建是能真正有希望治療角膜盲疾病最有效的措施。

1 Pellegrini G，Traverso CE，Franzi AT，Zingirian M，Cancedda R， De Luca M.Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated human epithelium［J］.Lancet，1997，349(9057):990-993.

2 Chee KY，Kicic A，Wiffen SJ.Limbal stem cells:the search for a marker［J］.Clin Experiment Ophthalmol，2006，34(1):64-73.

3 Kerkis I，Kerkis A，Dozortsev D，Stukart-parsons GC，Gomes Massirosi SM，Pereira LV，et al.Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers［J］.Cells Tissues Organs，2006，184(3-4):105-116.

4 Ahmad S，Stewart R，Yung S，Kolli S，Armstrong L，Stojkovic M et al.Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］.Stem Cells，2007，25(5):1145-1155.

5 Liu Qi，Chen WP.Research progress in the application of embryonic stem cells in vitro culture system in ophthalmology［J］. Yanke Yanjiu，2009，27(5):420-433.

6 Zhou SY，Zhang C，Baradaran E，Chuck RS.Human corneal basal epithelial cells express an embryonic stem cell marker OCT4［J］.Curr Eye Res，2010，35(11):978-985.

7 Nakamura T，Endo K，Kinoshita S.Identification of human oral keratinocyte stem/progenitor cells by neurotrophin receptor p75 and the role of neurotrophin/p75 signaling［J］.Stem Cells，2007，25(3):628-638.

8 Tao Q，Qiao B，Lv B，Zheng C，Chen Z，Huang H.p63 and its isoforms as markers of rat oral mucosa epidermal stem cells in vitro［J］.Cell Biochem Funct，2009，27(8):535-541.

9 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y，Watanabe K，Yamamoto K，Adachi E，et al.Cornea reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium［J］.N Engl J Med，2004，351(12):1187-1196.

10 Dogru M，Tsubota K.Survival analysis of conjunctival limbal grafts and amniotic membrane transplantation in eyes with total limbal stem cell deficiency［J］.Am J Ophthalmol，2005，140(2): 305-306.

11 Du Y，Funderburgh ML，Mann MM，SundarRaj N，Funderburgh JL.Multipotent stem cells in human corneal stroma［J］.Stem Cells，2005，23(9):1266-1275.

12 Arnalich-Montiel F，Pastor S，Blazquez-Martinez A，Fernandez-Delgado J，Nistal M，Alio JL，et al.Adipose-derived stem cells are a source for cell therapy of the corneal stroma［J］.Stem Cells，2008，26(2):570-579.

13 Gomes JA，Geraldes Monteiro B，Melo GB，Smith RL，Cavenaghi Pereira da Silva M，Lizier NF，et al.Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of human immature dental pulp stem cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51 (3):1408-1414.

14 Meyer-Blazejewska EA，Call MK，Yamanaka O，Liu H，Schl?tzer-Schrehardt U，Kruse FE，et al.From hair to cornea:toward the therapeutic use of hair follicle-derived stem cells in the treatment of limbal stem cell deficiency［J］.Stem Cells，2011，29(1): 57-66.

15 Madhira SL，Vemuganti G，Bhaduri A，Gaddipati S，Sangwan VS，Ghanekar Y.Culture and characterization of oral mucosal epithelial cells on human amniotic membrane for ocular surface reconstruction［J］.Mol Vis，2008，14(2):189-196.

16 Duan X，McLaughlin C，Griffith M，Sheardown H.Biofunctionalization of collagen for improved biological response:Scaffolds for corneal tissue engineering［J］.Biomaterials，2007，28(1): 78-88.

17 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

18 Harkin DG，George KA，Madden PW，Schwab IR，Hutmacher DW，Chirila TV.Silk fibroin in ocular tissue reconstruction［J］. Biomaterials，2011，32(10):2445-2458.

19 Wu J，Du Y，Watkins SC，Funderburgh JL，Wagner WR.The engineering of organized human corneal tissue through the spatial guidance of corneal stromal stem cells［J］.Biomaterials，2012，33(5):1343-1352.

20 Yoeruek E，Bayyoud T，Maurus C，Hofmann J，Spitzer MS，Bartz-Schmidt KU，et al.Reconstruction of corneal stroma with decellularized porcine xenografts in a rabbit model［J］.Acta Ophthalmol，2012，90(3):e206-210.

21 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

22 Cheng CC，Wang DY，Kao MH，Chen JK.The growth-promoting effect of KGF on limbal epithelial cells is mediated by upregulation of Np63 through the p38 pathway［J］.J Cell Sci，2009，122 (Pt 24):4473-4480.

23 Tseng SC，Chen SY，Shen YC，Chen WL，Hu FR.Critical appraisal of ex vivo expansion of human limbal epithelial stem cells［J］.Curr Mol Med，2010，10(9):841-850.

24 Daya SM，Watson A，Sharpe JR，Giledi O，Rowe A，Martin R，et al.Outcomes and DNA analysis of ex vivo expanded stem cell allograft for ocular surface reconstruction［J］.Ophthalmology，2005，112(3):470-477.

25 Ahmad S，Osei-Bempong C，Dana R，Jurkunas U.The culture and transplantation of human limbal stem cells［J］.J Cell Physiol，2010，225(1):15-19.

26 Colabelli Gisoldi RAM，Pocobelli A，Villani CM，Amato D，Pellegrini G.Evaluation of molecular markers in corneal regeneration by means of autologous cultures of limbal cells and keratoplasty［J］.Cornea，2010，29(7):715-722.