原生質體紫外誘變提高簡青霉的木質素降解性能

沈 瑩,胡天覺*,曾光明,吳娟娟,黃 超,劉 暉,黃丹蓮,尹 璐 (1.湖南大學環境科學與工程學院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學環境生物與污染控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082)

原生質體紫外誘變提高簡青霉的木質素降解性能

沈 瑩1,2,胡天覺1,2*,曾光明1,2,吳娟娟1,2,黃 超1,2,劉 暉1,2,黃丹蓮1,2,尹 璐1,2(1.湖南大學環境科學與工程學院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學環境生物與污染控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082)

以簡青霉Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA為出發菌株,對其進行原生質體紫外誘變.經過篩選獲得2株誘變菌株(J12與J18),它們的木質素降解酶酶活要明顯高于出發菌株J.其中誘變菌株J12產生的漆酶和錳過氧化物酶酶活較高,相對于出發菌株J分別提高了145%和47%,達到44.0,50.9 U/g.誘變菌株J18產生的木質素過氧化物酶酶活較高,達到67.1 U/g,相對于出發菌株J提高了40%.且木質素降解率也最高,相對于出發菌株J分別提高了198.1%.經過7次傳代, J12和J18的木質素降解酶活性保持穩定,沒有降低.

簡青霉；誘變；生物降解；木質素

木質素是一種難降解的天然有機物質,大量存在于植物秸稈、木材中,如水稻中木質素占秸稈總量的 20%～28%.木質素的結構十分復雜,嚴重制約了水稻秸稈等農業固體廢物的減量化、資源化和再利用.研究表明,微生物菌種如真菌,通過分泌木質素降解酶氧化斷裂木質素的化學鍵,有效降解木質素[1-5].木質素降解酶主要是指漆酶(Laccase)、木質素過氧化物酶(Lip)和錳過氧化物酶(Mnp).目前生物降解木質素的研究大多集中于白腐真菌如黃孢原毛平革菌等,對簡青霉等軟腐菌在相關方面的研究報道較少[6-7].簡青霉的研究報道多集中于其對纖維素的降解,而對于木質素的降解僅有少量研究報道[3-4].作者用篩選得到的一株產生上述 3種重要的木質素降解酶的簡青霉(Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA)[4]進行了原生質體制備及紫外誘變育種,研究其對木質素的降解能力.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

簡青霉(P. simplicissimum (Oudem.)Thom BGA),由湖南大學環境科學與工程學院“863”課題研究組提供[3,4].

1.2 培養基

基礎培養基(查氏培養基):NaNO32g, K2HPO41g,KCl 0.5g,MgSO40.5g, FeSO40.01g,蔗糖30g,瓊脂16g,蒸餾水1000mL,pH 6.0,121℃滅菌20min.

菌種保藏培養基(PDA培養基):去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂16g,蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min.

再生固體培養基:NaCl濃度為 0.7mol/L,其他同基礎培養基.

鑒別培養基1(愈創木酚PDA固體培養基):去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g,MgSO41.5g,蒸餾水 1000mL,滅菌后添加愈創木酚0.4g.

鑒別培養基2(Azure-B培養基)[8]:去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g, MgSO41.5g,天青-B(Azure-B) 0.1g,蒸餾水1000mL, 121℃滅菌20min.

鑒別培養基 3(RBBR)培養基[9]:去皮馬鈴薯200g,葡萄糖 20g,瓊脂 16g,KH2PO33g,MgSO41.5g,雷瑪唑亮藍(RBBR)0.625g/L,蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min[10].

固態發酵培養基:稱取烘干稻草 30g于1000mL錐形瓶中,加入70mL蒸餾水.121℃滅菌20min.

1.3 主要試劑和儀器

蝸牛酶(Snailase)購自合肥博美生物科技有限責任公司;穩滲劑:0.7mol/L的NaCl ;RBBR、Azure-B、2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、96% 藜蘆醇均購自于Sigma-ALDRICH公司.

紫外-可見光分光光度計(日本島津公司, UV-2550);光學顯微鏡(OLYMPUS BX61);顯微鏡照像機(Penguin 600CL,Pixera公司);環境掃描電鏡(FEI Quanta 200).

1.4 實驗方法

1.4.1 蝸牛酶酶液配制 用 0.7mol/L的 NaCl溶液配制 0.04g/mL濃度的蝸牛酶酶液,經0.22um的微孔濾膜過濾除菌.

1.4.2 原生質體紫外誘變[11]在無菌操作臺上,收集處于對數期(經培養 72h～120h)的簡青霉菌絲體約重 0.1g.將收集好的菌絲體按每 50mg菌絲體加入1mL蝸牛酶酶液的比例混合,37℃保溫2h,用 G3砂芯漏斗過濾去除菌絲碎片.濾液10000r/min離心10min,離心3次,沉淀即為純凈原生質體.

將稀釋至濃度為103個/mL左右的純凈原生質體溶液1mL均勻涂布于再生固體培養基平板上(平皿直徑9cm).置于10W的紫外燈下(照射前打開30min使光波穩定),距離50cm,于黑暗條件下分別照射 0,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20min.照射完畢后,馬上置于冰箱內在低溫條件(-5℃)下暗處理1h.然后,置于34℃恒溫培養箱中培養.每天觀察,待菌落數穩定后記下每個培養皿中的菌落數.

致死率(%)=(未照射的再生菌落數－照射后的再生菌落數)÷未照射的再生菌落數×100%

1.4.3 篩選 初篩:挑選在再生平板上長勢好的或發生形態變化的菌落,點植在鑒別培養基上,培養 5d,每天進行觀察,根據 RBBR培養基、Azure-B培養基和愈創木酚培養基上的生長和褪色情況判斷菌株降解木質素的能力.挑選在鑒別培養基上表現好的菌落劃線接種于PDA培養基平板上,繼續培養 5d后,重復鑒別培養和傳代過程,共轉7代.

復篩:挑取傳了7代,并在鑒別培養基上表現好的菌株進行生物降解木質素的產酶能力和降解性能測定.每隔 5d測一次木質素降解酶酶活,到第30d結束.比較出發菌株和誘變菌株產最大木質素降解酶的酶活,確定誘變菌株產酶性能是否穩定.

1.4.4 降解木質素能力測定 每瓶固態發酵培養基中加入濃度為1×106個/mL菌懸液10mL.每隔5d從上述培養基中取樣測定漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的酶活.同時用10g稻草裝瓶,相同條件接種培養,測定始末木質素、半纖維素和纖維素的含量,用于計算各組分絕對量的變化.

1.4.5 粗酶液制備 從固態發酵培養基中取出約2.00g±0.05g的固體樣品,裝入250ml錐形瓶中,并在瓶中加入20mL蒸餾水,稍作振蕩后,放入搖床中 150r/min振蕩浸提 1h;振蕩完畢后 10000 r/min離心10min,上清液可看作除去孢子的粗酶液,用于酶活的測定.

1.4.6 酶活和木質素降解率測定 木質素過氧化物酶[12]:于310nm測藜蘆醇被氧化成藜蘆醛的光密度變化.反應體系包括藜蘆醇(10mmol/L)、H2O2(10mmol/L)、0.1mol/L酒石酸緩沖液(pH 3.0)和粗酶液.定義每min使1μmol的藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量為一個酶活力單位(U).

錳過氧化物酶[13]:于240nm測Mn2+被氧化成 Mn3+的光密度變化.反應體系包括MnSO4(15mmol/L)、H2O2(10mmol/L)、0.05mol/L琥珀酸緩沖液(pH 4.5)和粗酶液.定義每min產生1μmol Mn3+所需要的酶量為一個酶活力單位(U).

漆酶[14]:于420nm測ABTS被氧化的光密度變化.反應體系包括 ABTS(1.0mmol/L)、100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)和粗酶液.定義每min轉化1μmol的ABTS所需的酶量為一個酶活力單位(U).

采用中性洗滌法、酸性洗滌法和72%硫酸法[15-16]來測定固態發酵物中的中性洗滌去除物含量、半纖維素含量、纖維素含量和木質素含量.

2 結果與討論

2.1 簡青霉生長曲線的測定

從圖1可以看出,第3d到第5d簡青霉菌絲體生長速率最大,是菌絲體生長的對數期,故選用這一時期的菌絲體來制備原生質體進行誘變.

2.2 簡青霉原生質體的制備及再生

在原生質體制備的實驗中發現菌齡對原生質體的形成影響很大.當菌絲體處于對數期時,原生質體的制備率最高.只用蝸牛酶處理就可以獲得較高數量的原生質體.通過預實驗計算,簡青霉出發菌株原生質體的制備率為16.9%、再生率為90.4%.簡青霉原生質體的高再生率,有利于進行下一步的紫外誘變.

圖1 簡青霉生長曲線Fig.1 Growth curve of Penicillium simplicissimum

2.3 簡青霉原生質體的紫外照射致死曲線

采用紫外線對簡青霉原生質體即出發菌株原生質體進行不同時間的照射,原生質體的致死率與誘變時間的關系如圖2所示.研究表明,當致死率在80%左右時,產生的正誘變菌株較多,但高致死率有利于篩選到產量提高幅度大的誘變菌株[17].本實驗選用紫外照射致死率在 80%～98%的誘變菌株用于初篩,并從紫外照射致死率在85%的處理中成功篩選出誘變菌株 J12,從紫外照射致死率在 97%的處理中獲得誘變菌株 J18.實驗結果表明該紫外照射致死率范圍內的誘變效果理想.

圖2 紫外線照射不同時間對原生質體致死率影響Fig.2 Effect of UV irradiation time on the death rate of the protoplast

2.4 誘變菌株篩選

依次重復在鑒別培養基上培養菌株、挑選誘變菌株和傳代的過程,傳7代后,篩選獲得2株誘變菌株J12和誘變菌株J18,它們在鑒別培養基上的褪色及生長情況均優于出發菌株J.

2.5 誘變菌株與出發菌株的形態比較

誘變菌株J18與出發菌株J相比,發生了形態學變化.誘變菌株 J12的孢子形態和菌落形態及大小與出發菌株J相同,未發生變化.

由圖3可見,誘變菌株J18的孢子形態為圓形,相對于出發菌株J的橢圓形孢子而言,形態學上發生了很明顯的變化.

圖3 出發菌株J孢子與誘變菌株J18孢子光學顯微鏡下觀察結果Fig.3 The spore morphology of original strain J, mutant strain J18(Seen in light microscope)A.出發菌株J孢子; B.誘變菌株J18

由圖4可以看出,培養相同時間后,誘變菌株J18的菌落顏色為深綠色,出發菌株J的菌落顏色為綠色,并且菌落直徑要大于出發菌株 J的菌落直徑.說明在相同條件下,誘變菌株J18的生長能力更強.

2.6 對木質素降解效果的比較

2.6.1 產木質素降解酶分析 從圖5可知,出發菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的最大木質素過氧物化物酶酶活都出現在固態發酵的第10d.誘變菌株J18產生最大的木質素過氧化物酶酶活,為67.1U/g,是出發菌株J的最大木質素過氧化物酶酶活48.0U/g的1.40倍,提高了40%,誘變后酶活提高較顯著.菌株 J12的最大木質素過氧化物酶酶活為44.4U/g,略低于出發菌株J.

圖4 出發菌株J與誘變菌株J18菌落形態Fig.4 Colony morphology of original strain J and mutant strain J18A.出發菌株J; B.誘變菌株J18

圖5 原始株和誘變株木質素過氧化酶酶活比較Fig.5 The activities of Lip of original strain and mutant strains數據為3次測量的平均值

從圖6可知,出發菌株J和誘變菌株J12的最大漆酶酶活出現在第20d,誘變菌株J18的最大漆酶酶活出現在第25d.誘變菌株J12的最大漆酶酶活為 44.0U/g,是出發菌株 J的最大漆酶酶活18.0U/g的2.45倍,提高了145%,誘變后酶活提高顯著.誘變菌株 J18的最大漆酶酶活為 20.8U/g,是出發菌株J的最大酶活17.9U/g的1.16倍,提高了16%.

圖6 原始株和誘變株漆酶酶活比較Fig.6 The activities of laccase of original strain and mutant strains數據為3次測量的平均值

圖7 原始株和誘變株錳過氧化物酶酶活比較Fig.7 The activities of Mnp of original strain and mutant strains數據為3次測量的平均值

從圖7可知,出發菌株J的最大錳過氧化物酶酶活出現在第5d,誘變菌株J12和誘變菌株J18的最大錳過氧化物酶酶活都出現在第 15d.從第20d開始,出發菌株J及誘變菌株J12、J18均檢測不出錳過氧化物酶酶活.誘變菌株 J12的最大錳過氧化物酶酶活為50.8U/g,是出發菌株J的最大錳過氧化物酶酶活34.6U/g的1.47倍,誘變后錳過氧化物酶酶活提高了 47%,誘變后酶活提高較顯著.誘變菌株 J18的最大錳過氧化物酶酶活是37.3U/g,略高于出發菌株J.

由表1數據可知,經過7次傳代,誘變菌株J18產生的最大木質素過氧化酶酶活、誘變菌株J12產生的最大錳過氧化物酶酶活和最大漆酶酶活相對于出發菌株 J仍然保持有極顯著提高(P＜0.01),誘變菌株J18產生的漆酶酶活相對于出發菌株J有顯著提高(P＜0.05),說明誘變菌株J12和誘變菌株 J18的遺傳性狀穩定.各菌株的木質素過氧化物酶酶活最大值和錳過氧化物酶酶活最大值出現的時間較接近且較早,而漆酶酶活的最大值出現最晚.產生這種現象的原因可能是漆酶對木質素的降解能力要弱于其他 2種木質素降解酶,木質素經過木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶一定程度的降解后,將更易于被漆酶降解,是 3種木質素降解酶在降解木質素方面協同作用的表現.

表1 出發菌株與誘變菌株經固態發酵產生的最大木質素降解酶酶活之間比較Table 1 Compared original strain with mutants in highest ligninolytic enzymes by solid fermentation

2.6.2 木質素降解能力的分析及比較 誘變菌株對木質素的實際降解能力如表 2所示,出發菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的木質素降解率,依次為9.94%、16.65%和29.63%.相對于出發菌株 J,誘變菌株 J12和誘變菌株J18的木質素降解率分別提高了 67.5%和198.1%,有極顯著提高(P＜0.01).中性洗滌的去除物主要是指用中性洗滌劑(pH7)消化植物細胞后,溶于中性洗滌劑中的細胞內容物,包括蛋白質、脂肪和無氮浸出物(糖類、淀粉和果膠)等物質.中性洗滌去除物是結構簡單的有機物,在固態發酵初期應首先被降解,但經過 30d的固態發酵后,固態發酵培養基中的中性洗滌去除物含量沒有減少反而增加,可能是復雜結構的半纖維素、纖維素及木質素被分解后所形成的產物.出發菌株J、誘變菌株J12和誘變菌株J18的中性洗滌去除物提高率,依次為12.85%、 22.48%和 30.80%,有極顯著提高(P＜0.01).相對于出發菌株J,誘變菌株J12和誘變菌株J18的中性洗滌去除物提高率分別提高了 74.9%和139.7%,有極顯著提高(P＜0.01).

表2 固態發酵前后木質纖維素組分質量變化Table 2 Quality changes of lignocellulose components before and after solid fermentation

2.7 討論

本實驗所用的固態發酵培養基中僅加入了水稻秸稈和蒸餾水,未加入任何其它營養物質或者對水稻秸稈進行任何形式的預處理.經過 30d的固態發酵誘變菌株J12和J18對固態發酵培養基的木質素降解率達到 16.59%和 29.68%.相對于培養天數相同,培養條件相似的菌種Phanerochaete chrysosporium、Pleurotus eryngii、Phlebia radiata、Ceriporiosis subvermispora和Ceriporiopsiss subvermispora對木質素的降解率6%～11%[18-19],誘變菌株J12和J18對木質素的降解效果顯著.

由實驗結果可知,誘變菌株 J18對木質素降解能力最強,這主要是由于誘變菌株 J18分泌的木質素過氧化物酶酶活最大.自然界中木質素是由非酚結構的木質素單元和酚結構的木質素單元組成的結構復雜的酚類聚合物,其中非酚結構的木質素單元大約占木質素結構單元的90%[7,20],一般情況下,只有木質素過氧化物酶能降解非酚結構的木質素,因此木質素過氧化物酶酶活大小對木質素的降解影響極顯著.盡管誘變菌株 J18在漆酶和錳過氧化物酶的提高率上不如誘變菌株 J12,但其對木質素的降解率卻要優于誘變菌株 J12.由此可見,本實驗中木質素過氧化物酶在對木質素降解中所起的作用要大于其他2種木質素降解酶.中性洗滌去除物可以被用于大部分土壤微生物的初級代謝,因此中性洗滌去除物含量越高,越有利于多種土壤微生物的共生作用和協同作用.經過30d的固態發酵,培養誘變菌株 J18的固態培養基中的中性洗滌去除物增加量是誘變菌株J的2.46倍,有利于土壤中各類微生物利用協同作用對土壤中的木質纖維素進行降解,更易于形成腐殖質,提高土壤的養分.誘變菌株J12的木質素過氧化物酶雖然略低于出發菌株J,但因其漆酶和錳過氧化物酶的酶活要顯著高于出發菌株J,因此其對木質素的降解率要明顯高于出發菌株 J.由此可見,在本實驗中漆酶和錳過氧化物酶對木質素的降解作用雖然沒有木質素過氧化物酶大,但其作用不容忽視.誘變菌株 J12盡管對木質素的降解率差于誘變菌株

J18,但其漆酶產量很高,可用于漆酶產生機理的研究和木質素降解酶之間協同作用的研究.

3 結論

3.1 通過對簡青霉原生質體進行紫外誘變,顯著提高出發菌株 J的木質素降解酶酶活.誘變菌株J12的漆酶酶活提高145%、錳過氧化物酶酶活提高47%.誘變菌株J18的木質素過氧化物酶酶活提高40%.

3.2 誘變后的菌株對木質素的降解能力得到了顯著提高.誘變菌株 J18對木質素降解率提高198.1%.誘變菌株 J12對木質素降解率提高67.5%.

3.3 誘變菌株經過7次連續傳代接種,對木質素保持高效的降解率,具有遺傳穩定性.

3.4 木質素過氧化物酶對木質素的降解能力大于其他2種木質素降解酶,其在木質素降解過程中起主要作用的機理有待作進一步的深入研究.

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Improving lignin degradation ability of Penicillium simplicissimum by UV induced protoplast mutagenesis.

SHEN Ying1,2, HU Tian-jue1,2*, ZENG Guang-ming1,2, WU Juan-juan1,2, HUANG Chao1,2, LIU Hui1,2, HUANG Dan-lian1,2, YIN Lu1,2(1.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Ministry of Education, Hunan University, Changsha 410082, China). China Environmental Science, 2012,32(3)：485～491

The aim of this study was to obtain new Penicillium simplicissimum mutants with high yield of ligninolytic enzymes. UV induced mutagenesis of protoplast was performed on original strain Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BGA. Two genetically stable mutant strains J12 and J18 were selected from a large amount of the regenerative mutants. The highest laccase and manganese peroxidase (Mnp) activities produced by strain J12 were 1.45 and 0.47-fold higher than that by original strain, reached 44.0 U/g and 50. 9 U/g, respectively. The highest lignin peroxidase (LiP) activity of 67.1 U/g was obtained by strain J18, which was 0.4-fold increased compared with its original strain. The highest degradation rate of lignin also was obtained by strain J18, which increased 1.98-fold compared with its original strain. Further experiment confirmed after seven generations successively propagating the activity of strain J12 and strain J18 were stable and did not decrease generally.

Penicillium simplicissimum；mutagenesis；biodegradation；lignin

X705

A

1000-6923(2012)03-0485-07

2011-06-22

湖南省自然科學基金(07JJ5053);湖南省高校創新平臺開放基金項目(11K013);中央高?；究蒲袠I務費

* 責任作者, 副教授, hutj66@yahoo.com.cn

沈 瑩(1982-),女,遼寧鞍山人,湖南大學環境科學與工程學院碩士研究生,主要研究方向為微生物對有機固體廢物的降解.發表論文2篇.