200例非綜合征型聾患者GJB3和GJB6基因突變分析＊

陳塏鈿 宗凌 周蔚 劉敏 姜鴻彥

遺傳因素在先天性聾病因中占重要位置。目前發現的致聾基因超過60 個，常見的有：GJB2、SLC26A4、線粒體DNA、GJB3、GJB6 等，以GJB2基因最常見［1～3］，GJB3和GJB6基因突變在遺傳性聾患者中已見報道［4～6］。GJB3可表現為雙等位基因座突變，或與GJB2基因表現為雙基因復合雜合突變［6］。GJB3和GJB6的總體突變率較低［7～9］。

目前我國廣東、湖南和廣西三省的非綜合征型聾患者的GJB3和GJB6基因突變資料尚缺，因此，本研究對來自這三省的200例非綜合征型聾患者進行GJB3和GJB6基因突變篩查，分析這兩個基因的人群突變率，為今后這些地區的耳聾人群基因篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集來自廣東、廣西和湖南非綜合征型聾散發病例200例，男118例，女82例，其中廣東144例，湖南28例，廣西28例，均為先天性聾或后天遲發性雙耳聾。病例就診時年齡11 月～47歲，平均7.75±6.56歲。耳聾分級參照WHO 1997年日內瓦推薦的標準，根據聽力較好耳0.5、1、2、4 kHz的純音平均聽閾［10］分為：正常：＜25dB HL；輕度聽力損失：26～40dB HL；中度：41～60dB HL；重度：61～80dB HL；極重度：≥81dB HL；本組患者中輕度6例，中度12例，重度33例，極重度149例。每位患者均進行詳細的病史采集和系統的體格檢查，排除可能的致聾病因（高膽紅素血癥、腦膜炎、腮腺炎后遺癥等）及綜合征型聾。聽力學檢查包括純音聽閾、聲導抗和耳聲發射，嬰幼兒或配合欠佳患者行聽性腦干反應（ABR）及聽性穩態反應（auditory steady state responses，ASSR）檢查?；颊呋蚱浼覍俸炇鹬橥鈺?，采集患者外周血4 ml，采用常規氯仿抽提法提取DNA，－80 ℃保存。應用1%瓊脂糖進行電泳和分光光度計進行DNA 純度和濃度鑒定。中山大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核并同意此項研究。

1.2 引物設計 GJB3引物序列為F：TACGATGGTTTTTCCTCTAATTCT，R：TTGCATAACTTAGTGAACTCAGAG，PCR 產物長度985 bp。GJB6引物序列為F：TATCACCGTGTCACTTTCC，R：CAGGTTGGTATTGCCTTC，PCR 產物長度937bp。參照文獻［11］，合成檢測del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）突變的引物，引物由上海生工公司合成。

1.3 PCR 擴增 PCR 反應采用25μl反應體系，2×PCR Buffer mixture 12.5μl，DNA 50ng，引物各5pmol，加ddH2O 至25μl。反應條件：94 ℃預變性5分鐘，94 ℃變性30秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，35 個循環，反應結束后再72 ℃延伸7分鐘，4 ℃保存。取2μl進行1%瓊脂糖電泳檢測PCR 產物。del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）采用Touch－Down PCR，反應條件詳見文獻［11］。取6μl PCR 產物進行瓊脂糖電泳，直接判斷野生型或大片段缺失突變。

1.4 PCR 產物測序 PCR 產物純化后，以PCR 引物作為測序引物進行測序反應，利用ABI公司3730測序儀進行Sanger測序反應。

1.5 序列比對 應用chromas軟件分析測序結果，測序結果與GJB3 （NM＿001005752.1）和GJB6（NM＿001110219.2）基因組序列進行對比分析。

2 結果

200例非綜合征型聾患者中，發現GJB3 580G＞A（A194T）雜合突變2 例，其中1 例為GJB2 109G＞A（V37I）和GJB3 580G＞A （A194T）復合雜合突變（圖1），另外1例GJB2和GJB6基因均未發現突變；250G＞A （V84I）雜合突變1例（也未發現GJB2和GJB6突變），474G＞A（M158I）雜合突變1例（表1）。前兩種突變位點均已見報道［7，8］，突變位于connexin 31 蛋白高度保守區，可能為病理性突變。474G＞A 雜合突變導致第158位蛋氨酸變為異亮氨酸，突變的性質暫不明確。此外，這200例患者中，發現357C＞T 雜合突變35例，357C＞T純合突變1例，由于正常人群中也存在357C＞T 純合突變，該突變可能為多態性突變。據此推算，廣東、湖南和廣西三省非綜合征型聾人群中，GJB3等位基因突變頻率約為1% （4／400）。

圖1 GJB3和GJB2雙基因復合雜合突變

表1 200例非綜合征型聾患者GJB3基因篩查結果

200例患者中均未發現GJB6基因突變。對del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）的特異性PCR 擴增，電泳結果均為330bp的條帶，未發現GJB6 大片段缺失突變。

3 討論

本研究結果顯示，本組非綜合征型聾患者GJB3等位基因突變頻率約為1%，突變位點以580G＞A為主（2例，0.5%），均未發現GJB6突變，說明GJB6在這些人群中突變率極低，在臨床篩查中可暫不列為常規檢測項目。

Liu等［6］報道，GJB3 基因580G＞A 突變形式表現為GJB3 580G＞A＋GJB2 235delC 或GJB3 580G＞A＋GJB2 299－300delAT 復合雜合突變，這個突變位于connexin 31蛋白高度保守區，在200例正常人群中也未發現，但在先證者的正常聽力的親代發現雜合突變。因此，這個突變可能為致病性突變，突變形式為隱性遺傳。本組也有一例病例表現為GJB3 和GJB2 復合雜合突變，其中，GJB2 109G＞A 的致病性仍存在很大的爭議［12，13］，GJB2 109G＞A 被認為是病理性突變［12，13］，或增加環境易感性的突變。本組GJB2和GJB3復合突變的病例，推測為遺傳因素引起的耳聾，其致病機制暫不明確。

GJB3 250G＞A 突變由李慶忠等［7］首先報道，他們在150名正常對照組中未發現同樣突變，各物種多種連接蛋白氨基酸序列進化分析證實該突變位點位于connexin31高度保守的第二跨膜區。關于GJB3 580G＞A 和250G＞A 的致病機制尚需進一步深入研究。此外，本組病例中發現1例患者攜帶GJB3 474G＞A 雜合突變，該突變引起第158 位蛋氨酸變為異亮氨酸，突變的性質暫不明確，正常人群中尚未發現攜帶此突變。該突變位點對應的氨基酸非位于高度保守區，推測該突變致病可能性低。

GJB6突變報道見于Marlin 等［5，11］報道，多見于歐美人群［11，14］。與GJB2 不同，GJB6 基因突變在國人耳聾患者中并不常見［8，9］。本研究廣東、廣西和湖南200例非綜合征型聾患者中未發現GJB6突變，推測GJB6在國人非綜合征型聾患者中并非主要致病基因。GJB6突變中，兩種大片段缺失突變del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）比較多見［11，14］，其致病機制可能為通過反式效應（in cis effect）作用于上游的GJB2 基因，抑制GJB2基因mRNA 的表達而致聾［15，16］。本研究參照del Castillo等［11］方法，對200 例非綜合征型聾患者進行這兩種突變的檢測，均未發現突變，與韓東一等［8，9］的研究結果一致，說明在國內耳聾人群中，GJB6基因突變可暫不列入臨床常規檢測項目。

本研究也存在一定的不足：首先，病例樣本數量仍較少，今后需要進一步增加樣本數，并合理分配病例的地域來源，以更好地驗證本研究結果。其次，對GJB3可能的病理性突變位點，如GJB3 580G＞A和250G＞A 的致病機制，尚需進行深入的研究。

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