ABRA在不同年齡大鼠腰段脊髓中的表達變化

劉麗華 伍校瓊 楊寶林 關瑩露 簡曉紅 朱 武 蔡維君＊？剼？

（1中南大學基礎醫學院組織學與胚胎學系，長沙410013；2中南大學基礎醫學院人體解剖學與神經生物學系，長沙410013；3湖南師范大學醫學院護理系，長沙410013）

ABRA（Actin binding Rho activator）也稱為STARS（striated muscle activator of Rho signaling）與MS1（Myocyte Stress－1），是近年 Arai等人首先在心臟發現的一種結合在肌小節I帶的43 kD的肌動蛋白結合蛋白（actin－binding proteins，ABPs），能激活Rho信號，使肌動蛋白單體（G－actin）與肌動蛋白絲（F－actin）結合增加，從而增強肌動蛋白的多聚化，并對多聚化形式的actin有穩定作用［1－4］。其C末端含有兩個獨立的F－actin結合區域 （ABD1／ABD2），具有肌動蛋白結合功能［5］。Kuwahara等研究發現ABRA參與了心肌肥大與心肌病的病理過程［6］，Lamon等發現在阻力訓練引起的骨骼肌肥大中，ABRA表達上調［7］，Troidl等發現提高側支血管ABRA的表達能明顯地促進側支血管的快速生長［4，8］。這些研究表明ABRA參與調節actin的功能，增強actin的多聚化，從而對心肌、骨骼肌、平滑肌細胞的功能具有重要的作用。最近，我們課題組發現ABRA在神經系統中也有表達，提示ABRA在神經系統亦具有一定的作用［9］。脊髓神經元的分化演變，生長發育過程受各種理化因子或相關蛋白的調節與控制，如角蛋白、神經細絲蛋白等［10］。作為ABPs新加入的成員之一，ABRA是否對脊髓的生長發育具有一定作用呢？此前，ABRA在不同年齡大鼠脊髓中表達未見相關報道。為此，本研究運用Western blot及免疫熒光術檢測ABRA在不同年齡階段大鼠腰段脊髓的表達變化，為進一步研究其在脊髓中的功能活動提供形態學基礎。

材料和方法

1.材料

不同年齡階段正常SD大鼠（中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供）共計36只，雄雌不限，新生鼠（生后7d）、成年鼠（6m）、老年鼠（20m）各 12只。其中不同年齡階段的各6只用于蛋白質提取，其余用于免疫組織化學檢測。所有動物的實驗處理過程，均按中南大學實驗動物操作規則進行。

2.方法

2.1 Western blot檢測

不同年齡階段大鼠腹腔麻醉后，在冰上將各組腰段脊髓（L4－L6）迅速取出，稱重后，以100 mg／ml加入組織裂解液（1∶100加入蛋白酶抑制劑），冰浴勻漿。以1℃，12000轉／分鐘離心20min左右，吸取上清，以BCA法進行蛋白定量，沸水中煮沸變性，冷卻后置4℃保存。分別取不同年齡階段腰段脊髓組織蛋白樣品各40μg，行SDS－PAGE（分離膠濃度為10%）電泳，后進行濕式電轉移。轉移后的NC膜（Millipore公司）用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉90min，兔ABRA多克隆抗體 （1∶200，sigma，美國）和鼠GAPDH抗體室溫孵育1 h后，4℃過夜，然后轉入 HRP－羊抗兔IgG（1∶2000）和HRP－驢抗鼠IgG（1∶1000）中，室溫孵育2h，每次抗體孵育后均用TBST漂洗10min×3次，ECL發光，顯影，定影。免疫印跡照片用激光掃描儀掃描成圖片后用Image－pro plus（IPP）6.0軟件分別測定各蛋白條帶的光密度（OD）值，以ABRA條帶的OD值與相應內參GAPDH條帶的OD值比值表示ABRA蛋白相對量。

2.2 灌注取材和切片準備

將實驗用大鼠，以10%水合氯醛溶液經腹腔注射（4mg／kg）麻醉成功后，剪開胸腔，顯露心臟，從左心室插管至主動脈，剪開右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水，待流出的液體清亮后，再灌注4%多聚甲醛固定。取腰段（L4－L6）脊髓放入4%多聚甲醛溶液中后固定，常規梯度浸糖至組織塊沉底后取出，OCT復合物包埋，用三頓冷凍切片機連續切片，片厚15μm。

2.3 免疫熒光組織化學顯色

組織切片用5%BSA封閉1h后同時加入一抗兔來源ABRA多克隆抗體 （1：50，sigma，美國）與小鼠來源 Neu N單克隆抗體（1：2000，sigma，美國），4℃過夜，然后加入生物素化羊抗兔IgG（1：200，sigma，美國）及偶聯熒光素Cy3的驢抗鼠IgG（1：200，sigma，美國），室溫孵育2 h，再加入鏈霉親和素偶聯的熒光素 Cy2（1：500），室溫孵育lh，其中除5%BSA封閉之外，其余每次抗體孵育后均用0.01mol／L PBS洗3次，每次10min。

陰性對照用PBS代替一抗，其余各步驟均同，以排除二抗的非特異性染色。

Nikon熒光顯微鏡觀察并拍照，圖片用EZ－C1 3.70 FreeViewer進行處理。

2.4 統計學處理

結 果

1.ABRA在不同年齡階段腰段脊髓中的蛋白水平表達變化

Western blot結果顯示，與成年組、老年組比較，新生組大鼠腰段脊髓中的蛋白表達水平最高，差異具有統計學意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統計學意義，有代表性的印跡條帶及至少三次重復實驗光密度掃描后統計結果 （見圖1）。

2.ABRA在不同年齡階段腰段脊髓中的細胞定位

在腰髓前角，ABRA廣泛表達于神經元的胞核、胞漿和突起，與前角運動神經元存在共定位（圖2、圖6）。陽性細胞計數顯示：與成年組（0.33±0.05）、老年組（0.36±0.02）比較，新生鼠（0.18±0.03）ABRA＋Neu N雙陽性細胞占總ABRA陽性細胞百分比最低，差異具有統計學意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統計學意義（圖3）。

在腰髓后角，ABRA與小的Neu N（神經元標記物）陽性感覺神經元存在共定位，也主要表達在神經元胞核、胞漿和突起內（圖4）。陽性細胞計數顯示：與成年組（0.67±0.06）、老年組（0.71±0.05）比較，新生鼠（0.40±0.04）ABRA＋Neu N雙陽性細胞占總ABRA陽性細胞百分比最低，差異具有統計學意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統計學意義（圖5）。

討 論

ABRA是2002年Arai等使用差異基因篩選獨自鑒定的表達在小鼠胚胎心臟的新基因［1］以及Mahadeva等利用分子索引鑒別的在左心室負荷過大下的調節基因［2］，隨后的研究發現ABRA還參與了心肌肥大、骨骼肌肥大的病理過程及側支血管生長，ABRA通過參與調節actin的功能，增強actin的多聚化，對心肌、骨骼肌、平滑肌細胞的功能起重要的作用［4，6－8］。

我們課題組前期研究顯示ABRA在神經系統中廣泛表達，ABRA可見于神經元的胞核、胞漿、突起內，提示ABRA可能在神經系統中具有一定的作用［9］。在本實驗中我們對各年齡組腰段脊髓ABRA的表達進行了觀察，并發現不同年齡階段大鼠腰段脊髓中均檢測到ABRA的表達，且在不同年齡階段表達有變化，新生大鼠腰髓中ABRA蛋白水平表達最高，成年鼠及老年鼠表達下調且維持在一定的生理水平，推測ABRA作為ABPs新成員之一，可能與神經細胞內其他ABPs一樣，如profilin［11］、tropomysin［12］等，通過調節actin絲的形態、長度，影響神經細胞的生長、遷移及形態的改變，進而影響器官的發育，傷口的愈合等［13－15］。ABRA在新生大鼠腰髓中表達最強，這可能與大鼠發育早期神經系統發育分化等有關，至成年及老年仍維持在一定的生理水平，可能與ABRA參與調節actin的多聚化，維持成熟神經元結構功能的穩定性有關的。

本實驗中免疫熒光染色顯示ABRA廣泛分布于各年齡組前角運動神經元，推測ABRA可能與腰段脊髓前角運動神經元的發育分化和出生后長期的神經元生存維持作用有關。在后角，ABRA高表達于感覺神經元，提示ABRA可能與外周感覺傳入有關。新生鼠ABRA＋Neu N雙陽性細胞占總ABRA陽性細胞百分比顯著低于成年組、老年組，提示ABRA在大鼠發育早期不僅表達在神經元內，可能還表達于非神經元細胞內，共同影響大鼠的神經系統發育。

目前，有關ABRA與神經系統發育的研究只是剛剛起步，深入研究ABRA與神經系統發育的關系對于重新認識ABPs在神經系統的發育作用及進一步闡述相關疾病的機制具有重要意義，本文的結果為探討ABRA在發育期腰段脊髓中的作用提供了一些形態學證據。ABRA在腰段脊髓表達及隨發育時段而變化的事實提示ABRA可能參與腰段脊髓的發育成熟、突觸的形成以及神經可塑性調節過程。

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圖 版 說 明

圖1 Western blot檢測ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓中的表達變化1.新生鼠2.成年鼠3.老年鼠。GAPDH作為上樣對照。＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05。

圖2 免疫熒光雙標顯示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中的分布A－A"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在新生鼠腰段脊髓前角的雙標記B－B"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在成年鼠腰段脊髓前角的雙標記C－C"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在老年鼠腰段脊髓前角的雙標記Bar＝50μm 綠：ABRA 紅：Neu N

圖3 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中ABRA＋Neu N雙陽性細胞占總ABRA陽性細胞百分比

＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05

圖4 免疫熒光雙標顯示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中的分布

A－A”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在新生鼠腰段脊髓后角的雙標記

B－B”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在成年鼠腰段脊髓后角的雙標記

C－C”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在老年鼠腰段脊髓后角的雙標記

Bar＝50μm 綠：ABRA 紅：Neu N

圖5 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中ABRA＋Neu N雙陽性細胞占總ABRA陽性細胞百分比

＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05

圖6 ABRA亞細胞定位圖

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of ABRA during the lumbar spinal cord of newborn、adult and aged rats by Western blot 1，newborn rats；2，adult rats；3，aged rats.GAPDH served as a loading control.＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.2 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats A－A"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn rats B－B"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of adult rats C－C"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of aged rats Bar＝50μm green：ABRA red：Neu N

Fig.3 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.4 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats A－A”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn rats B－B”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of adult rats C－C”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of aged rats

Fig.5 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats

Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups Fig.6 Subcellular location map of ABRA