BCRP/ABCG2的結構功能及相關抑制劑研究

應帥，鄭婷婷，陳培遠，郭輝輝，許傳蓮

化學治療是臨床上治療癌癥的一種主要方式。研究發現多重耐藥菌（multi-drug resistance，MDR）主要是由一類被稱為ABC 轉運蛋白超家族（ATP binding cassette transporters）的膜蛋白所引起的，它們能夠利用 ATP 水解提供的能量將化學治療藥物排出細胞外，導致腫瘤細胞呈現抗藥性。BCRP/ABCG2（breast cancer resistant protein）屬于ABC 轉運蛋白超家族 G亞族的第二位成員，是造成多種癌細胞產生 MDR的主要原因之一。

乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）由一個位于N 末端的核苷酸結合結構域（NBD）和一個位于C 末端的橫跨膜結構域（MSD）組成，被稱為半轉運蛋白，因此 BCRP 很有可能是形成同源二聚體或低聚物發揮功能。

BCRP 不僅分布于多種腫瘤細胞中，而且還廣泛分布于人體的正常組織中，如腦、胎盤、小腸、肝臟、睪丸、卵巢、前列腺等[1]。BCRP 轉運許多在結構和功能上不相關的外源性藥物如米托蒽醌、喜樹堿及其衍生物 SN-38等，同時也能夠轉運多種內源性物質。因此，BCRP 在藥物體內的吸收、分布、排泄中都發揮了重要作用[2]。

此外，BCRP 在腫瘤細胞的側群細胞中高表達，可以作為干細胞檢測的標記物[3]，并且已發現多種潛在的BCRP抑制劑，如 FTC（fumitremorgin C）及其衍生物 Ko143等。但是關于BCRP的三維結構及其分子作用機制尚不清晰，還有待進一步的研究。

1 ABCG2的發現

BCRP 由 Doyle等[4]從阿霉素抗性的MCF-7 乳腺癌細胞株 MCF-7/AdrVP 中首先克隆得到的。隨后，Miyake等[5]從米托蒽醌抗性的直腸癌細胞株，Allikmets等[6]從人類胎盤組織中相繼克隆得到類似基因，分別命名為MXR和ABCP。BCRP、MXR和ABCP 作為同源蛋白，只有個別氨基酸序列存在差異，依據人類基因命名委員會的推薦，將該蛋白統一命名為ABCG2。BCRP 屬于ABC 跨膜轉運蛋白超家族 G亞族的第二位成員，與P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）同為常見的3 種藥物抗性蛋白。

2 BCRP的結構與功能

BCRP 基因位于染色體 4q22，全長 66 kb，由 16個外顯子和15個內含子組成，編碼 655個氨基酸，蛋白大小為72 kD。BCRP 僅由一個 ATP結合域和一個由 6個α 螺旋結構的橫跨膜結構域組成，與其他的全轉運蛋白P-gp 或 MRP1（含兩個或兩個以上的MSD和NBD結構）相比，BCRP 屬于半轉運蛋白[7]。一般情況下，半轉運蛋白位于細胞內，而全轉運蛋白位于細胞膜。BCRP是第一個被發現位于細胞膜上的ABC 半轉運蛋白[8]。此外，BCRP 在結構上與其他亞族的轉運蛋白如 P-gp、MRP1 存在明顯差異，其 ATP結合結構域位于N 端，而跨膜結構域位于C 端。正是由于BCRP 具有這些獨特的結構特征，越來越受到研究者的關注。Wang等[9]的研究結果首次證明了 BCRP的MSD 氨基和羧基末端位于細胞內的6-TM模型，這些研究結果對于了解 BCRP 轉運機制具有重要的作用。

一般認為，一個功能性的ABC 轉運蛋白需要兩個或者兩個以上的MSDs和NBDs 才能形成一個底物轉移通道。因此，BCRP 作為半轉運蛋白很有可能是形成同源二聚體或低聚物而發揮功能的。Ni等[10]運用雙分子熒光互補技術，并結合熒光共振能量轉移（FKET）檢測了 BCRP 二聚體/低聚物的形成。有報道認為ABCG2是通過分子內二硫鍵的連接形成功能性的同源二聚體結構[11]，Kage等[12]的早期研究發現在還原條件下，聚丙烯酰胺凝膠電泳上得到的BCRP 分子量為70 kD；而在非還原條件下，得到了 140 kD的化合物，這一結果預測 BCRP 通過二硫鍵形成了同源二聚體。Liu等[13]研究結果顯示，Cys284、Cys374和Cys438三個 Cys 殘基共同發揮作用，維持人源 ABCG2-R428G的功能。而位于第三個細胞外環（Loop-3）上的Cys 殘基（如Cys592、Cys603和Cys608）發生突變，并不影響 ABCG2的功能；與之相反的是，Shigeta等[14]研究認為BCRP 作為一種功能性的轉運蛋白，并不需要形成 Cys 介導的共價二聚體，此外，位于Loop-3 上的Cys603和Cys608 或許也參與了 BCRP 二聚體的形成；而新的研究顯示，由于分子間的非共價鍵的相互作用，ABCG2 或許以一種更易形成的低聚物形式存在。Xu等[15]通過對 TM5-loop-TM6 重組片段研究發現，該片段能夠形成寡聚化，因此認為該區域對于BCRP的寡聚化非常重要。

總之，關于BCRP 最小的功能單元是否是同源二聚體以及是否以二聚體/低聚體的狀態發揮與藥物結合與轉運的功能，目前尚未有確論。BCRP 形成功能性二聚體/低聚體或許是由于分子內二硫鍵形成、分子間非共價蛋白與蛋白相互作用共同發揮作用的結果，這些需要對 BCRP 形成同源二聚體或低聚物的機制進行更深入的研究[16]。

3 BCRP的組織分布及在藥物代謝中的作用

BCRP 定位于細胞膜，關于BCRP的蛋白表達和mRNA 已在多種類型的人類癌癥中檢測到，包括惡性血液腫瘤和一些固體瘤。ABCG2 在食管鱗癌中呈高表達，不僅與腫瘤的分化、患者臨床分期有關，還與有無淋巴結轉移密切相關，因此 ABCG2 可能是導致食管鱗癌患者化療不敏感的主要原因，尤其是中晚期患者[17]。

BCRP 主要分布在具有分泌和排泄功能的組織中。因此，BCRP 作為一種高效的外排泵對藥物和外源性物質在體內的吸收、分布、排泄等過程中發揮著重要作用，越來越多的研究認為BCRP 在藥物的處理和組織保護中也起到了重要作用[1-2]。Enokizono等[18]研究顯示，BCRP 限制了外源性化合物如 MeIQx、PhIP、Prazosin等在腦和睪丸中的分布，與P-gp 共同形成了血腦屏障；Cisternino等[19]研究表明 ABCG2 存在于鼠血腦屏障中并發揮了重要的生理學功能，ABCG2的表達能夠有效地限制腦對米托蒽醌和哌唑嗪的吸收，限制藥物滲透進入腦，并造成潛在的藥物相互作用。由于BCRP 在血腦屏障中主動外排治療藥物，降低藥物在腦部的藥效，因此需要設計一些新的策略來避免中樞神經系統中由 BCRP 介導的多藥耐藥。Mahringer和Fricker[20]研究發現，17β 雌激素通過活化大鼠腦部毛細血管的ERβ，從而下調 BCRP的轉錄和翻譯水平，這一結果有助于提高中樞神經系統疾?。ㄈ缒X癌）中 BCRP 底物的靶向性治療，也有助于了解在長期攝入植物雌激素和口服藥物過程中BCRP 與藥物之間的相互作用。Hirano等[21]研究顯示，在人源或鼠源 BCRP 表達系統中，BCRP 識別并參與肝膽對匹伐他汀的外排作用，這與MRP2 主要介導了肝膽對他汀類的外排作用的觀點相反。Merino等[22]研究發現 BCRP是呋喃妥英生物利用度的一個重要決定因素，并參與肝膽將呋喃妥英分泌至乳汁中，但在呋喃妥英的泌尿排泄中并未發揮實質性的作用。

4 BCRP的轉運底物

近些年來的研究發現 BCRP 具有廣譜的轉運底物，主要分為外源性底物和內源性物質，發揮對組織器官的保護和解毒作用。

4.1 外源性底物

首先，BCRP能有效地外排抗癌化學治療藥物，如米托蒽醌、喜樹堿類（拓撲替康、伊立替康及其代謝物SN-38）、葉酸拮抗劑（甲氨蝶呤）、表鬼毒素（伊托泊苷、替尼泊苷）、黃酮類抗腫瘤藥物（flavopiridol）等，同時也能轉運一些新型的分子靶向類藥物，如酪氨酸激酶抑制劑（伊馬替尼、吉非替尼）和脂肪酸酰胺類水解酶抑制劑（達努塞替）；其次，BCRP 也能主動轉運一些熒光染料類化合物如 BOPIPY-Prazosin、羅丹明 123、Hoechst33342、Lyso-Tracher，這些熒光性底物常用于研究 BCRP的表達水平和轉運功能。此外，BCRP 還能轉運一些化學毒素，如pheophorbide a、PhIP等[16-23]。

4.2 內源性底物

BCRP能轉運對細胞生理學動態平衡起重要作用的內源性化合物，如固醇類（膽固醇、雌二醇、類固醇）及其類固醇硫酸鹽（E3S、DHEAS）[24-25]、血紅素、卟啉[26]、核黃素[27]、硫酸鹽化的雌激素[28]以及某些葉酸和抗葉酸劑[29]等。

5 BCRP的抑制劑

克服多藥耐藥的方法就是利用一些高效的調節劑來抑制 ABC 轉運蛋白的作用。已發現越來越多的化合物可作為BCRP的抑制劑，本文根據各種化合物的特性將 BCRP的抑制劑分為四類。

5.1 BCRP 特異性抑制劑

主要包括 FTC 及其類似物、新生霉素等。FTC是一種從煙曲霉中分離得到的霉菌毒素，在體外能特異性逆轉由BCRP 介導的多藥耐藥，增加抗癌藥物的細胞毒性，因此FTC 被廣泛用于檢測 BCRP 在MDR和藥物處理實驗中的藥理學探針[30-31]。Gonzalez-Lobato等[32]研究結果表明，人源 BCRP 對 FTC的抑制效果比鼠源 BCRP1 更為敏感。這種選擇性抑制對于研究體內細胞毒性和藥理作用具有重要作用，可用于BCRP1/BCRP 抑制劑的研發。

FTC 雖然是一種高效、特異性強的BCRP 抑制劑，但由于其具有神經毒素作用而限制了在體內的使用。Allen等[33]鑒定了新的FTC 四環類似物 Ko132、Ko142和Ko143，這三種FTC 類似物能有效地抑制人源 BCRP和鼠源的BCRP1的功能，增加細胞內藥物的積累，并逆轉BCRP1/BCRP 介導的多藥耐藥，同時對 P-gp和MRP1等ABC 家族轉運蛋白的抑制活性較低。此外，它們在高口服劑量的小鼠體內沒有任何毒性。Ko143能抑制鼠小腸中BCRP1的功能，并顯著增加拓撲替康在小鼠體內的口服利用度，這是第一個適用于體內的高效特異性 BCRP 抑制劑。此外，新生霉素作為一種從鏈霉菌中產生的抗生素，能增加拓撲替康在MCF/TPT300 細胞中的積累，特異性抑制BCRP的外排作用[34]，有望發展為用于臨床治療中 BCRP的候選抑制劑。

5.2 ABC 轉運蛋白家族的廣譜特異性抑制劑

GF120918（elacridar）是一種有代表性的第二代 P-gp抑制劑，現已證明對 BCRP和MRP1 具有一定的抑制活性[35]。根據 GF120918的結構進行改造和修飾的衍生物如tariquidar（XR9576）也抑制 BCRP的藥物外排作用。Pick等[36]以 tariquidar 為先導結構設計得到了一些新型有效且特異性強的BCRP 抑制劑；Kühnle等[37]通過對 tariquidar苯甲酰胺核心結構進行修飾，合成得到的化合物是迄今為止所發現的最有效、特異性強的BCRP 抑制劑之一。

抗 HIV 藥物作為一種逆轉劑廣泛應用于逆轉由 BCRP介導的MDR，研究發現 BCRP 表達于CD4+T 細胞株，對核苷逆轉錄酶抑制劑具有耐藥性，可作為提高 HIV 治療的靶標[38]。

5.3 酪氨酸激酶抑制劑

酪氨酸激酶抑制劑（the tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是一類新型的抗癌藥物，能通過與幾種致癌酪氨酸激酶的催化結構域競爭 ATP結合位點起作用。疏水性的TKIs能與ATP 依賴的主動轉運蛋白如 BCRP 相互作用，有效地影響藥物在體內的代謝。gleevec（imatinib mesylate，STI-571）和CI1033作為TKIs能夠逆轉 BCRP 介導的對喜樹堿類如拓撲替康的耐藥作用[39]。OSI-930 類似物 VKJP1和VKJP3 通過直接與BCRP的底物結合位點相互作用從而特異性抑制 BCRP的功能[40]。Dohse等[41]證明伊馬替尼、尼洛替尼和達沙替尼這三種TKIs 都是 ABC 轉運蛋白ABCB1和BCRP的轉運底物，但是在較高濃度下可克服轉運蛋白的功能。治療劑量的伊馬替尼和尼洛替尼具有可以削弱 ABCB1和BCRP 限制口服吸收或產生耐藥性的潛能，但還需要更多的臨床數據來證實。在BCRP 高表達的膜囊泡或細胞中，尼洛替尼能抑制 BCRP 對甲氨蝶呤（MTX）和米托蒽醌（MRX）的轉運[42]。

5.4 BCRP的黃酮類化合物及其衍生物抑制劑

天然黃酮及其衍生物作為第三代 P-gp和MRP1 抑制劑的研究已有較多報道，并且與BCRP 有較高的親和力，在克服 BCRP 介導的腫瘤細胞耐藥性方面具有顯著效果，能增加特定抗腫瘤劑的細胞毒性，如染料木黃酮、柚配基、金合歡素和山奈酚等可加強 7-乙基-10-羥基喜樹堿和鹽酸米托蒽醌對 BCRP 誘導產生耐藥的K562 細胞的細胞毒性。槲皮素可以加強他莫西芬的抗腫瘤效應，與阿霉素（doxorubicine）合用可降低耐藥細胞 P-gp的數量[43]。Katayama等[44]篩選得到了 32 種黃酮類化合物并研究其對 BCRP的抑制活性，結果發現許多黃酮化合物只能選擇性抑制 BCRP 活性，而對 P-gp 以及MRP1 幾乎不具有抑制作用。其中化合物 3',4',7-三甲基黃酮對 BCRP 顯示了很強的抑制活性，它對 SN-38和MXR的RI50分別為0.012和0.044 μmol/L。水飛薊素、橙皮素、槲皮素和大豆苷元等能直接與BCRP 相互作用，并調節其轉運功能和ATP 活性，從而增加細胞內米托蒽醌的積累[45]。美國國立癌癥研究所（NCI）運用高通量篩選方法從天然產物提取物資源庫進行篩選，結果顯示有 8 種熱帶植物提取物能顯著地抑制 BCRP的功能[46]。Merino等[47]的研究結果表明，大豆異黃酮、染料木黃酮和大豆苷元通過對 BCRP1的抑制顯著減少了排泄至乳汁中的呋喃妥英，而 BCRP/ABCG2在藥物外排和藥物轉運至乳汁過程中所起的作用已被證實。

目前研究僅限于分析某一種黃酮化合物在蛋白質水平對 BCRP 表達的影響及對細胞內藥物聚集濃度的影響，由于蛋白質水平不能完全反映 BCRP 介導的耐藥性機制，有必要從 mRNA 水平分析黃酮化合物對 BCRP的表達影響，以及在耐藥細胞株中 BCRP的表達差異與增加藥物敏感性的關系，據此優化活性顯著的結構單元，這對設計更好靶向 BCRP的抑制劑是至關重要的。許多臨床研究表明，BCRP 抑制劑與治療藥物聯合使用是保證藥物有效性的一條有效策略。因此，我們研究小組通過借鑒傳統中醫中藥配伍原則，進行不同結構類型黃酮苷衍生物組合配伍逆轉BCRP 介導的多藥耐藥性的探索，發揮協同增效、多靶點增加腫瘤細胞對藥物的敏感性。

6 BCRP 對干細胞增殖和分化的影響

越來越多的研究表明 BCRP 廣泛表達于干細胞中，并獲得了眾多研究者的關注，積極探索它在干細胞發育生物學中的潛在作用。SP 表型是指腫瘤干細胞具有轉運熒光染料Hoechst 33342的能力。研究發現 BCRP 參與SP 表型形成，Zhou等[3]首先發現 BCRP1/ABCG2 基因是一種SP 表型的決定因素，可作為多種腫瘤干細胞的標記物。BCRP 富集于各種非造血和造血組織的干細胞或祖細胞中。Ahmed等[48]發現 BCRP 在造血祖細胞中高表達而沉默于分化了的造血細胞中，這一結果表明 BCRP 在早期造血中發揮了作用。Martin等[49]研究表明在細胞分化時期，SP 干細胞中BCRP的表達顯著下降。

BCRP 選擇性表達表明其可作為未分化 HuES 細胞的標記物。此外，保護胚胎干細胞抵抗外源性和內源性化合物取決于BCRP的表達和調節[50]。在膠質瘤干細胞中檢測到BCRP的表達，而且 BCRP的表達水平與膠質瘤的發展成正相關，這說明 BCRP 可能是黑素瘤發展的標志物[51]。Chen等[52]基于一種RNA 干擾方法發現 BCRP的抑制能有效阻止癌細胞的增殖。由于在干細胞中的保守表達，BCRP可能可以作為一種普遍的標志物區別不同組織的干細胞。

另外，BCRP 在加速增殖和阻斷干細胞分化中起著特殊效果，這揭示了在干細胞基礎治療中的一種潛在應用。此外，BCRP 作為一種已知的干細胞和祖細胞的標記物，在缺氧條件下能夠增強細胞的生存優勢[53]。因此，隨著對 BCRP的更深入研究將會為干細胞和癌癥治療開辟一條新的道路。

7 展望

BCRP 作為ABC 超家族 G 家族的新成員，由于其特殊的結構以及重要生化特性和生理功能，尤其在腫瘤的發生、診斷、治療中潛在的應用前景而越來越受到人們的關注，成為ABC 轉運蛋白結構與功能及其與多藥耐藥性相關研究的重要熱點之一。近 10 多年來，對 BCRP 轉運蛋白的生理功能、轉運機制、臨床耐藥機制及其耐藥逆轉的研究雖然取得了一定進展，但仍有待于進一步深入研究。

目前，對 BCRP 體內外功能研究方面已經取得了較大的進展，例如確認了越來越多的底物和抑制劑，以及BCRP對這些外源性或內源性底物在吸收、排泄、分布等方面發揮的重要作用。BCRP 不僅廣泛分布于人的多種正常組織中，是血腦屏障、胎盤屏障、血睪屏障等重要生理屏障的組成部分，同時也高表達于某些血液腫瘤和固體瘤中。而 BCRP 在干細胞的側群細胞中的保守表達為干細胞提供了一種保護功能，并可作為區分某些干細胞的標記物。因此，通過對正常細胞與腫瘤細胞中 BCRP 表達及功能差異點的研究，以尋求合適的作用于腫瘤細胞及腫瘤干細胞的藥物靶點，可能會成為腫瘤治療的新的研究方向。此外，BCRP具有促進干細胞的增殖及阻止其分化等特殊作用，這也揭示了 BCRP在干細胞治療方面具有潛在的應用前景[54]。

雖然人們早已意識到 BCRP 在腫瘤細胞多藥耐藥性中發揮重要作用，但是通過使用 BCRP的抑制劑避免癌癥患者對臨床藥物耐藥性的治療方法還未實現。這就需要進一步開發高抑制效能、高特異性、低毒的BCRP 抑制劑以及合理設計臨床試驗。此外，我們認為需要更加深入全面地了解BCRP的作用機制。例如 BCRP 如何識別底物以及其擁有廣譜特異性底物的決定因素？如何轉運底物以及在底物轉運過程中如何與ATP的水解相偶聯？BCRP 最小的功能單位是同源二聚體還是其他低聚物？對這些問題的答案仍未清楚，迫切需要進行進一步研究解決這些問題[16]。此外，高分辨 BCRP 三維結構的缺少使得對 BCRP轉運分子機制的認識難度大大增加。

相信新的實驗技術方法的應用、藥物基因組學的發展、新突變位點的發現，必將有助于進一步闡明 BCRP 轉運蛋白的生理功能及其轉運機制。

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