應用飛行時間質譜測定食品中多種真菌毒素的研究進展

張曉波，黃麗英，陳萬勤，陳小珍，曹 慧，莫衛民

(1.浙江工業大學化學工程與材料學院，浙江杭州 310014;2.浙江省質量檢測科學研究院，浙江杭州 310013)

真菌毒素 (mycotoxin)也稱霉菌毒素，是由產毒真菌在適宜的環境條件下產生的有毒代謝產物［1］。目前已發現的真菌毒素大約有300～400種［2］，廣泛存在于糧油等食品中。隨著食品安全問題越來越受到重視，真菌毒素的研究亦逐漸被人們所關注。這些產毒真菌可污染原料、飼料，進而污染食品，進入人類生物鏈;同時在食品生產、加工和運輸過程中都可能受到危害［3］。真菌毒素不僅能導致食品腐敗變質、營養損失及品質降低，還具有致癌、致畸、致突變和免疫抑制毒性［4］，對健康造成極大威脅。

目前比較常用的真菌毒素檢測技術有薄層色譜法 (TLC)、酶聯免疫 (ELISA)、液相色譜法(LC)、氣相色譜法 (GC)、液相質譜法 (LC/MS)等。雖然各有其優越性，但因同一食品可能受多種真菌毒素污染，一種真菌又可能產生多種毒素［5］，而食品基質復雜、干擾組分多，使單極質譜易出現假陽性，故不能很好解決多種真菌毒素同時檢測的問題。目前常采用液相色譜-三重四極桿串聯質譜(LC-QQQ/MS)分析真菌毒素，其采用多反應監測 (MRM)模式進行檢測，但仍受分辨率、結構模式和掃描速率等限制，適合少量化合物的準確分析，不能滿足復雜基質高通量快速篩查及精確定性分析的需求［6］。

飛行時間質譜 (TOF-MS)是利用動能相同而質荷比不同的離子飛越既無磁場又無電場的離子漂移管，經儀器記錄精確飛行時間，根據時間推算出速度，并利用動能與質量的關系推導出離子質量，從而對物質成分或結構進行分析的方法［7-8］。TOFMS較其他質譜而言有2方面優勢。 (1)高分辨率。TOF-MS的分辨率在20 000 FWHM以上，可精確到小數點后4位，質量準確度在一定線性范圍內可小于2×10-6，從而有利于分析母離子和碎片離子的元素組成［9-10］。 (2)全掃描，高通量［11］。TOF-MS利用質荷比與時間的關系進行質量分析，絕大多數離子源產生的離子均可到達檢測器，都能快速顯示在一張圖譜上，質量范圍寬。在這個過程中既省去了離子篩選過程，又不需要采用任何電流或電壓掃描，因此大大提高了離子傳輸效率，適合全掃描下高通量檢測。

TOF-MS的這些優勢在農藥殘留及獸藥殘留等食品安全分析中得到應用。隨著對真菌毒素分離鑒定研究的深入，飛行時間質譜也逐步應用到真菌毒素的研究。為此，本文綜述了TOF-MS的不同離子源在真菌毒素方面的應用，并對TOF-MS、四級桿-飛行時間串聯質譜 (Q-TOF)和離子阱-飛行時間(IT-TOF)質譜技術在真菌毒素方面的應用進行了總結。

1 比較不同的TOF-MS離子源檢測真菌毒素

不同的離子源適用于不同類型的樣品，目前適用于TOF-MS的離子源有電噴霧離子源 (ESI)、大氣壓化學電離源 (APCI)和大氣壓光致電離源(APPI)。

1.1 ESI離子源

ESI離子源是目前色譜-飛行時間質譜中最常用的一種離子源，ESI屬軟電離技術，適用于強極性、熱不穩定化合物。在TOF-MS同時檢測多種真菌毒素方面，ESI源最為常用，是真菌毒素檢測的首選離子源。

鄭翠梅等［12］報道了LC-ESI-TOF/MS同時檢測小麥和玉米中鐮刀菌、曲霉菌和青霉菌產生的13種真菌毒素，對比了在ESI+模式下和ESI-模式下13種真菌毒素響應情況，發現脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?(3-ADON)和玉米赤霉烯酮在ESI-模式下有更高的靈敏度。由于正負離子模式頻繁轉換帶來的不穩定性，而在正模式下也可滿足試驗要求，故采用正離子模式檢測。試驗考查了ESI源不同裂解電壓對離子豐度造成的影響，列舉了HT-2毒素隨著裂解電壓的增大，各種離子豐度的變化情況， ［M+NH4］+逐漸降低，而 ［M+Na］+逐漸升高。Sirhan等［13］使用Q-TOF-MS/MS在ESI源模式下對花生、玉米等44種食物樣品中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2進行同時檢測。在試驗過程中考察了不同流動相、有機相比例、流速、毛細管電壓、霧化器壓力和碎裂電壓等因素對離子化的影響，優化了4種毒素同時檢測的條件。Senyuva等［14］利用無花果干培養真菌以獲得代謝物真菌毒素。在運用LC/TOF-MS分析各種毒素時發現，所有化合物都在ESI源的作用下有響應，如伏馬毒素、黃曲霉毒素、土震素等大都以 ［M+H］+的形式存在。試驗還發現，在所有影響ESI的參數中，碰撞誘導解離電壓對結果影響最大。在不改變其他參數的情況下，碰撞誘導解離電壓可在55～250 V范圍內優化，最小解離電壓在150 V，一般選擇55～220 V進行試驗效果較為理想。試驗還發現赭曲霉毒A素對裂解電壓十分敏感。

1.2 APCI離子源

APCI離子源通過電暈針放電使空氣中的中性分子發生電離產生帶電離子，這些離子與樣品分子進行離子-分子反應，使樣品分子離子化，適合于中等或小極性相對穩定的小分子 (分子量小于1 000～2 000 u)化合物［15］。APCI源與 ESI源相比，最大的優勢是中性或弱極性化合物有更好的靈敏度，極性和非極性溶劑都可使用，比ESI源能忍耐更高濃度的鹽和添加物［15］。到目前為止，關于多種毒素同時檢測的文獻報道中，ESI源最為常用，但其應用于鐮刀毒素的效果不理想，特別是DON 及其共軛體。Zachariasova［16］利用 TOF-MS研究啤酒中的多種真菌毒素，在優化色譜條件下，對比了APCI和ESI兩種離子源對32種真菌毒素離子化作用的影響。除赭曲霉毒素A和3-乙?；撗跹└牭毒┐纪?，其他鐮刀菌毒素在APCI離子源下的信號響應值比ESI源強12倍，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇增強10倍。鐮刀菌毒素的靈敏度提高的原因可能是APCI離子源模式能夠消除鈉鹽和鉀鹽的分子離子峰的影響。Tanaka等［17］對比了ESI和APCI離子源模式下13種真菌毒素的響應，同樣發現鐮刀菌毒素在APCI下能獲得最佳響應，故最終選擇APCI檢測真菌毒素。

1.3 APPI離子源

APPI離子源基于高頻氣流放電燈產生真空-紫外10～10.6 eV的光子，使大多數有機物 (大部分有機物第1電離點位IP=7～10 eV，水的IP=12.6 eV，甲醇的IP=10.8 eV，乙腈的IP=12.2 eV)離子化，離子化的 ［M］+.從水蒸汽或者質子溶劑中得到H.后形成 ［M+H］+，其擅長于低極性到中等極性化合物的高靈敏度電離分析［18］。Tanaka等［19］利用LC-APPI-TOF-MS分析了日本201批餅干樣品的雪腐鐮刀菌烯醇 (NIV)，DON，FX，3-ADON，HT-2，T-2，玉米赤霉烯酮等7種真菌毒素，對比了ESI源、APCI源和APPI源在檢測這些毒素方面的特點。ESI源對于3-ADON檢測靈敏度很高，定量下限達到1 pg，但基質效應也很強。APPI源研究NIV，DON，ZEN毒素時，能提供較優的靈敏度，其檢出下限分別為1.8，2.5和1.3 pg。研究表明，與 ESI，APCI相比，APPI擁有較理想的線性范圍和靈敏度，基質干擾弱和離子抑制作用小，對非極性化合物有著很高的靈敏度等特點。Takino［18］對比了 APCI與 APPI離子源在檢測蘋果汁中棒曲毒素的應用，APPI在負源的模式下獲得 ［M-H］-m/z153的準分子離子，而APCI獲得最強的 ［M］-m/z154信號和 ［M-H］-m/z153信號，兩者線性范圍與檢測限相近，有區別的是APPI的圖譜雜質干擾更少。于1 d后檢測同樣的樣品，APPI的信號強度是原來的90%，而APCI只有原來的50%。目前APPI離子源在真菌毒素方面的報道還較少。

2 質譜技術在真菌毒素方面的應用

2.1 TOF 在快速篩選真菌毒素及代謝未知物方面的應用

由于TOF-MS質譜具有高分辨率，可獲得化合物的精確質量數，為相似的未知化合物或離子篩查提供了較高的可信度和準確度。

Tanaka等［17］用LC/TOF-MS測定糧食及其制品中的單端孢霉烯族毒素、黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等3類13種真菌毒素。在質量窗口寬度0.03 TH，100 ng·mL-1混標濃度下，2個質量數相差0.02 TH的雪腐鐮刀菌烯醇準分子離子 ［M+NH4-H2O］+和 ［M］+在 TOF-MS高分辨質譜中能得到很好的分辨，這在低分辨質譜是做不到的。Bartok等［20］利用反相高效液相色譜-飛行時間質譜和離子阱質譜研究伏馬毒素B1及其28種同分異構體，在保留4.826～32.808 min內獲得伏馬毒素B1及其同分異構體，獲得的26個同分異構體分子的精確質量數與伏馬毒素B1的精確質量數之差在0.1×10-6～1.7×10-6，其中有2個同分異構體與伏馬毒素 B1相差在4.3×10-6和 -2.8×10-6。Bartok等［21］利用 ESI-IT-MS和 ESI-TOF-MS 研究了被鐮刀菌污染的谷物培養基，發現了3對同分異構體，經裂解和精確質量數的分析，3對同分異構體為伏馬毒素B1與脂肪酸，棕櫚酸和亞油酸酯化反應的產物，其毒性、極性與伏馬毒素顯著不同，對毒素毒理學研究有重要意義。Vekiru等［22］采用LC/TOF-MS技術研究了經酵母毛孢子菌轉化的玉米赤霉烯酮主要代謝產物，研究采用液相色譜對樣品進行梯度洗脫使基質和目標物分離，在ESI-源模式下采用TOF-MS的全掃描檢測，在總離子流圖中提取相關的色譜峰，測得未知代謝物的保留時間和準分子離子 (m/z351.1445)，再根據碎片離子峰的精確質量數和運用元素組成分析軟件，參考核磁譜圖，結合化合物的裂解規律，得到未知代謝物的元素組成為C18H24O7，代謝物分子量誤差為1.1×10-6。

2.2 Q-TOF及IT-TOF串聯質譜技術在真菌毒素方面的應用

隨著研究的細化和深入，加之食品樣品基質的復雜性和真菌代謝產物的多樣性，造成了譜圖的復雜化，使用單級質譜難以滿足試驗要求，而QTOF、IT-TOF等串聯質譜不僅可由譜圖中的母離子進行鑒別，而且可通過一定的方式對碎片離子進行細化鑒別［10］。

2.2.1 Q-TOF質譜串聯在真菌毒素方面的應用

Q-TOF質譜是將四極桿質譜與飛行時間質譜進行串聯，將四級桿的高靈敏度與飛行時間的高分辨率進行高質量精度結合，在選擇性離子檢測模式下，四級桿將單一選擇性目標離子送入兩質譜間的碰撞活化室，通過碰撞誘導解離，經加速后進入TOF離子漂移管，實現質量分離［23］。Sirhan等［24］在LC-ESI-QTOF-MS/MS技術的基礎上開發了一種對谷物中8類A型和B型單端孢霉烯族進行研究的新方法，在多反應監測 (MRM)模式下采用低能量碰撞誘導串聯質譜 (CID-MS/MS)進行定量測定。過程中不使用固相萃取柱進行凈化。采用直接進樣，既節約了時間，又減少了分析成本。采用正負兩種離子模式分別對A型和B型單端孢離子進行研究，獲得了更低的檢測限和更高的靈敏度和選擇性。

結合TOF-MS精確質量分析優勢，通過建立質譜庫即可實現同時對多種真菌毒素的快速篩查，而無需標準物質，QTOF-MS使未知化合物結構推斷變得便捷。Diaz［25］利用QTOF-MS建立了目標離子和非目標離子的2種篩選方法，對大規模不同類型樣品的有機污染物進行分離分析。根據自動提取精確質量數進行目標篩選，根據自制的譜庫和試驗對比進行非目標排查。該方法應用在快速篩選食品中的霉菌毒素和伏馬菌素方面，取得較滿意的效果。普通的質譜分析時，由于離子的去質子化和一些加合離子的存在，可能影響分析的精確度及可信度，而Q-TOF采用二級碎片離子和精確質量數結合，既分析準分子離子，又尋找譜庫中的碎片離子的精確質量數，大大提高了分析的可信度［26］。

2.2.2 IT-TOF串聯質譜在真菌毒素方面的應用

IT-TOF是將離子阱質譜與飛行時間質譜進行串聯，把離子阱全掃描模式下的高靈敏度及多級碎裂功能與飛行時間質譜高分辨率和精確分子量測定相結合，極大地提高了分析復雜基質中的痕量化合物結構的能力。通過三維空間的穩定電勢區，離子阱把離子拘禁在阱內，通過選擇性地積累離子，從而提高目標離子濃度，以達到提高靈敏度的目的，同時又能進一步裂解實現多級高分辨檢測［27］。如果能夠將此技術很好運用在真菌毒素的裂解規律上，可大大提高分析真菌毒素的能力。liu等［28］用LC-ESI-IT-TOF-MS研究了鐮刀菌產生T-2、HT-2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON)、3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (3-AcDON)和雪腐鐮刀菌醇 (NIV)5種真菌毒素，基于2，3級質譜圖和精確質量數，提出了5種真菌毒素的裂解規律，研究發現A類鐮刀菌如T-2和HT-2毒素采用 ［M+Na］+裂解模式，共同脫去異戊?；鸵宜峄?，而B類鐮刀菌DON，3-AcDON和NIV采用 ［M-H］-模式，三者的環氧裂解模式都相同。裂解碎片的研究利于5種鐮刀菌毒素的分析鑒定。

3 TOF質譜技術在真菌毒素應用及展望

綜上所述，TOF-MS在食品真菌毒素方面有廣闊的應用前景。TOF-MS具有高分辨、全掃描、高通量等優勢，適合于復雜的食品基質，可實現多種相似結構與相近分子量的毒素分析。由母離子和碎片離子的精確分子量信息，結合創庫軟件，可創建真菌毒素譜庫，便于對復雜體系高通量快速篩選。通過與四級桿質譜相連，提高了分析的靈敏度和檢出限;通過與離子阱質譜相連，達到了多級碎裂精確分析，從而提高了真菌毒素結構分析能力?？深A見TOF-MS在食品真菌毒素研究領域將成為研究應用的熱點。

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