AQP4與星形膠質細胞脹亡之間的關系

黃鶴鳴 褚曉凡

暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院神經內科，廣東深圳 518020

腦缺血后神經元凋亡的機制及引起凋亡的兩條細胞信號傳遞路徑（線粒體路徑及受體介導路徑）已經被證實。然而作為腦組織的主要組成成分，腦缺血后膠質細胞的損傷機制及死亡路徑尚未得到足夠的重視。這些星形膠質細胞廣泛分布于灰質、白質中，對于維持神經系統正常功能起到重要作用。因此明確腦缺血后星形膠質細胞通過什么方式和途徑死亡十分重要，能夠為通過保護星形膠質細胞來保護神經元的治療方案提供參考，會給腦缺血后神經保護帶來意外的收獲。

1 脹亡（Oncosis）

目前將細胞死亡主要分為兩類，一是細胞凋亡（apoptosis），另一類被稱作偶然性細胞死亡（accidental cell death）[1]。紊亂的自體吞噬代表在器官重塑及某些特定的病理過程中的第三種細胞死亡方式。Majno及Joris等提議除了細胞凋亡之外，大部分情況下的細胞死亡比較貼切的描述應該是偶然性細胞死亡，即“脹亡”，因為這種細胞損傷及死亡伴隨著細胞腫脹。Trump曾經對細胞凋亡、脹亡及壞死進行系統性描述[2]。細胞壞死是細胞死亡后所發生的一系列分解反應，是細胞的一種不可逆改變，主要包括核溶解、核固縮、核破裂、核結構喪失及細胞內碎片形成。而凋亡及脹亡是細胞死亡之前的反應性表現，是細胞的兩種死亡方式。凋亡及脹亡的主要區別在于細胞的體積、膜形態，細胞進入凋亡還是脹亡與所在組織的ATP水平有關[3]。在細胞凋亡的過程中，細胞皺縮，胞突或者生泡，但是細胞膜的通透性保持不變，細胞核裂解，細胞核染色質凝集，最終細胞碎裂成多個凋亡小體[1]。脹亡與細胞能量耗竭有關，有研究發現輕度解偶聯蛋白2（UCP-2）表達的增加會導致急劇的線粒體膜電位下降，細胞內ATP的合成減少，此時細胞膜離子泵功能喪失，水及離子進入細胞內，細胞腫脹，內質網及高爾基體擴張，線粒體腫脹后凝集，核染色質結塊，形成游離細胞器形成的胞質泡，最終細胞脹亡[1-4]。有研究指出，脹亡，如同凋亡一樣，可以通過細胞表面受體被激活，比如PORIMIN受體[5]。這兩種死亡方式均是提前被編碼好的，遺傳信息、相關酶和很多其他因素提前存在于細胞中。最近關于細胞損傷及死亡的研究指出在不可逆性細胞損傷的末期脹亡占主導地位[6]。我們的研究發現在同一個病灶中，細胞脹亡和凋亡可同時出現并表現出一定的分布特征，血液供應相對充足部位由于能量相對富足因此凋亡多見，而血供缺乏的區域則細胞脹亡多見。腦缺血中心區細胞以脹亡為主，周邊區以凋亡為主[7]。

脹亡是指致命性細胞損傷如缺血或許多化學毒素中毒之后的細胞死亡前期狀態[1]。有人提出脹亡性細胞死亡主要包括3個時期：在第一個時期，細胞主要因選擇性膜損傷開始進入脹亡過程，由于ATP合成障礙導致細胞能力耗竭，離子泵功能喪失，水和離子進入細胞內，導致細胞腫脹，但是在這一時期，細胞膜的通透性并沒有發生改變。在第二個時期，細胞損傷變的不可逆，此期碘化物及臺盼藍能夠通過細胞膜，意味著發生了非選擇性的細胞膜通透性改變。在第三個時期，細胞最終出現膜物理性崩解，即發生了細胞壞死[4]。由于脹亡伴隨著細胞內外水平衡的破壞，故脹亡與調節水平衡的水通道之間的關系密不可分。近幾年來，越來越多的研究對細胞脹亡的發生進行了報道，比如：動脈硬化斑塊中的細胞死亡[8]，由于放射導致的細胞死亡[9]，由于缺血性心臟病及腦卒中導致的細胞死亡等[10]。我們之前的研究顯示持續局灶腦缺血中心區域星形膠質細胞的死亡方式也是脹亡，其是以細胞腫脹和核溶解為特征的一種細胞死亡過程[11]。

2 星形膠質細胞的脹亡

在大腦中，星形膠質細胞的數目是其他神經元數目的5倍以上，星形膠質細胞在中樞神經系統中有重要的作用。包括維持細胞外離子及水平衡，協助神經遞質的傳遞及代謝，組成血腦屏障，參與大腦的修復過程等[12-13]。當嚴重的腦缺血發生時，血腦屏障及內皮細胞功能紊亂會導致星形膠質細胞腫脹，激活興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EEA）的釋放，誘導星形膠質細胞死亡。因此，阻止星形膠質細胞膨脹或EAA的釋放已經成為神經保護的靶點[14]。

有很多研究報道在腦缺血早期出現星形膠質細胞腫脹的現象。但是，這些腫脹的星形膠質細胞的命運及最終死亡通路目前并不明確，對于腦缺血后的星形膠質細胞死亡通路究竟是凋亡還是脹亡存在很多不同的觀點。在培育的星形膠質細胞中，有人認為缺血會誘導凋亡[14]。在活體實驗中，在大鼠腦一過性缺血后，在電鏡下很少能夠觀察到凋亡星形膠質細胞的存在[15]。有研究發現在培育的星形膠質細胞中，剝奪氧供及葡萄糖后，由于血腦屏障及內皮細胞功能的損害出現星形膠質細胞脹亡[16]。但是Gabryel及其同事持有不同的意見，他們認為在腦缺血之后的幾秒鐘內觀察到的星形膠質細胞腫脹實際上是膠質細胞增殖的早期現象，反應性星形膠質細胞呈星形，GFAP免疫應答性增加，伴隨著線粒體數目增加以及酶介導的、非酶介導的抗氧化活動增強。Ito及其同事將缺血后星形膠質細胞腫脹看做細胞維持內、外環境穩定能力的紊亂[17]。在2003年時，有人提出腦缺血導致的神經細胞死亡可能與脹亡有關。采用頸內動脈線栓環扎法建立大鼠持續局灶腦缺血模型，觀察到在腦組織中無論是缺血中心區還是缺血邊緣區星形膠質細胞都是以腫脹為主[18]。缺血后3 h，缺血區星形膠質細胞核周邊區域發生異染色聚集，核膜完整性的破壞，缺血12 h后出現染色質的滲漏。Majno及Joris曾經描述脹亡的標志性表現是胞漿及細胞核腫脹，胞漿內細胞器官的破裂及核溶解，而且脹亡常由缺血及毒性物質引起，我們研究在持續局灶腦缺血中心區域發現星形膠質細胞的缺血性死亡形態學特征類似脹亡，這意味著脹亡可能是缺血性星形膠質細胞的死亡通路[11]。隨后，我們的實驗中星形膠質細胞行缺糖缺氧 （oxygen glucose deprivation，OGD）后，其Na+-K+-ATP酶活性隨OGD時間的延長而降低，流式細胞儀測的脹亡細胞比率則隨OGD時間的延長而增多?？梢娒浲黾毎嚷孰SNa+-K+-ATP酶活性降低而升高。前期研究已發現，星形膠質細胞的ATP隨OGD時間的延長而逐漸下降，脹亡比率明顯升高，在ODG 3 h內脹亡比率小于凋亡，3 h起逐漸超過凋亡，成為星形膠質細胞的主要死亡方式[19]。

3 APQ4及星形膠質細胞

水通道蛋白（Aquaporins，AQP）是胞膜上控制細胞水含量的蛋白。1991年，在紅細胞中發現了第一種水通道蛋白，目前已發現了位于不同部位的13種AQPs[20]。水主要在跨膜溶質濃度梯度的驅動下通過AQPs進行轉運。轉運的速率主要取決于單個通道的水通透性及胞膜上AQPs的位置及數量。AQP1、2、4、5、8 只對水有通透性，而 AQP6 還能允許Cl離子通過。AQP3、7、9、10允許甘油及可溶于水的小分子通過。AQP0、11、12的通透性至今仍不明了。在大腦中存在AQP1、4、9。AQP1位于腦室系統的脈絡叢中，主要參與腦脊液的產生。AQP9主要參與大腦的能量代謝，存在于星形膠質細胞及一部分神經元中。大腦中最多的水通道蛋白是AQP4，AQP4是一種只有30-kDa的疏水跨膜蛋白，是維持大腦水平衡的重要水通道蛋白，水主要在跨膜溶質濃度梯度的驅動下通過AQP4進行轉移。AQP4在腦水腫，癲癇，肝性腦病及腦腫瘤的病理生理過程中有重要的作用。由于AQP4主要在星形膠質細胞中表達，而且水轉移的速度主要由星形膠質細胞上調或下調AQP4的表達，改變其在胞膜的位置及改變其通透性決定的，這使星形膠質細胞成為研究很多神經系統疾病及探索治療這些疾病的新方案的靶點細胞。在星形膠質細胞中，AQP4主要在3個重要部分表達比較密集：血管周圍星形膠質細胞足突，在血腦屏障功能中有重要作用；在突觸周圍星形膠質細胞足突，在神經遞質的清除中有重要作用；與郎飛結及無髓鞘軸突接觸的足突，在K+的清除中有重要作用。血管周圍的星形膠質細胞足突是大腦內AQP4表達的主要位置[21]。

腦水腫分子學機制的基礎由Igor Klatzo提出，他將水腫分為兩大類，細胞毒性水腫及血管源性水腫，其中細胞毒性水腫與細胞脹亡密切相關[22]。如同在低鈉血癥及早期腦缺血中所見，細胞毒性水腫是由于能量耗竭導致細胞內水堆積及細胞失去調節其體積的能力。這使水從細胞間隙進入細胞，從血液進入腦實質。星形膠質細胞是在細胞毒性水腫過程中腫脹的主要細胞類型，星形膠質細胞腫脹也是腦水腫的重要早期狀態。

星形膠質細胞中表達的AQP4在腦缺血、腦外傷、腫瘤、炎癥及代謝障礙導致的腦水腫中有重要作用。AQP4在細胞毒性水腫中的重要作用的依據主要來自于AQP4基因沉默的小鼠中。腹膜內注射水會在5 min內產生嚴重低鈉血癥，隨后小鼠即因腦腫脹及顱內壓增高而死亡。而在AQP4基因沉默的小鼠中低鈉血癥導致死亡的比率顯著下降。這種保護作用與血腦屏障水通透性下降及進入腦實質的水的比率下降有關。AQP4基因沉默的小鼠對其他類型的細胞毒性腦水腫易感性也較低，如細菌性腦膜炎[23]。胞漿膜上的AQP4蛋白與聚集的細胞內蛋白綁定，如α-肌氧結合蛋白。有趣的是，α-肌氧蛋白基因沉默的小鼠也不易發生局灶性腦缺血引起的腦水腫[24]。上述研究提示抑制AQP4表達或功能的藥物能夠限制人類細胞毒性腦水腫。但是，AQP4基因敲除會使血管源性腦水腫加劇。在細胞毒性水腫中，AQP4基因敲除會使水進入大腦的速率降低，但是在血管源性水腫中，AQP4敲除還會使水從大腦中轉移出的速率下降。因此，AQP4在轉基因小鼠中過度表達會加劇細胞毒性腦腫脹[25]。

4 AQP4的調節

大腦內AQP4的位置及數量都被緊密調節。交互作用蛋白，缺氧，滲透壓改變，氨及轉錄信息均可以對AQP4進行長期調節；AQP4的短期調節主要依賴于受體，大部分都是G蛋白偶聯的胞膜受體，這些受體的激活劑包括肽類激素、類前列腺素、兒茶酚胺及氨基酸，受體及配體相互作用后發生磷酸化及去磷酸化。

有研究表明缺氧被認為能夠影響星形膠質細胞的AQP4表達。冠狀動脈阻塞，導致全腦缺氧，據報道缺氧/缺血24 h后，會出現AQP4表達下降[26]。在大腦中動脈阻塞過程中，尤其在有血管性損傷的部位，氧供沒有恢復的區域，AQP4的表達會快速下降[24]。但是，當細胞再次獲得氧供時，AQP4表達的下調可以被逆轉，再度給氧9～12 h后，出現AQP4的明顯表達增加[27]。在新生的動物中，短暫的3.5 min的窒息之后給氧6 h會出現全腦的AQP4表達下降[28]。而成年大鼠系統性缺氧2 h隨后恢復氧供9 h，會產生腦干AQP4表達增加[29]。對卒中后死亡的患者進行尸檢發現，缺血灶周圍星形膠質細胞AQP4表達增加[30]。在體內試驗中，缺氧對AQP4表達的作用不僅基于缺氧的范圍及程度，還與重新獲得氧供的范圍、重新獲得氧供的時間有關。這也許能夠解釋不同的缺氧模型中，如卒中，窒息或TBI中AQP4表達的差異。

5 結論

眾所周知大腦內水平衡主要通過水通道蛋白進行調節，而AQP4是星形膠質細胞主要的水通道蛋白，所以AQP4與星形膠質細胞的脹亡有必然的聯系。缺血缺氧，使AQP4的表達發生改變，最終導致星形膠質細胞內外水平衡被破壞，發生細胞脹亡。AQP4在細胞毒性水腫有重要的作用，AQP4究竟如何改變而導致星形膠質細胞脹亡均有待進一步研究，能夠為治療腦缺血等疾病的治療發現新的靶點。

[1]Majno G，Joris I.Apoptosis，oncosis and necrosis.An overview of cell death[J].Am J Pathol，1995，146（1）：3-15.

[2]Trump B.F，Berezesky I.K，Chang S.H，et al.The pathways of cell death：oncosis，apoptosis and necrosis[J].Toxicol Pathol，1997，25（1）：82-88.

[3]曹旭，褚曉凡.細胞脹亡的研究進展[J].中國病理生理雜志，2009，25（12）：2473-2477.

[4]Mills E.M，Xu D，Fergusson M.M，et al.Regulation of cellular oncosis by uncoupling protein 2[J].J Biol Chem，2002，277（30）：27385-27392.

[5]Ma F，Zhang C，Prasad K.V，et al.Molecular cloning of porimin，a novel cell surface receptor mediating oncotic cell death[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（17）：9778-9783.

[6]Buja L.M，Vela D.Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseased heart[J].Cardiovasc Pathol，2008，17（6）：349-374.

[7]Chu X，Qi C，Zou L，et al.Intraluminal suture occlusion and ligation of the distal branch of internal carotid artery：An improved rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion[J].J Neurosci Methods，2008，168（1）：1-7.

[8]Cornelissen M，Thierens H，De Ridder L.Interphase death in human peripheral blood lymphocytes after moderate and high doses of low and high LET radiation：an electron microscopic approach[J].Anticancer Res，2002，22（1A）：241-245.

[9]Crisby M，Kallin B，Thyberg J，et al.Cell death in human atherosclerotic plaques involves both oncosis and apoptosis[J].Atherosclerosis，1997，130（1-2）：17-27.

[10]Ohno M，Takemura G，Ohno A，et al.Apoptotic myocytes in infarct area in rabbithearts may be oncotic myocytes with DNA fragmentation[J].Circulation，1998，98（14）：1422-1430.

[11]Chu XF，Fu XJ，Zou LY，et al.Oncosis，the possible cell death pathway in astrocytes after focal cerebral ischemia[J].Brain Res，2007，1149：157-164.

[12]Aschner M.Astrocytic functions and physiological reactions to injury：the potential to induce and/or exacerbate neuronal dysfunction-A forum position paper[J].Neurotoxicology，1998，19（1）：7-17，discussion 37-38.

[13]Tsacopoulos M，Magistretti P.J.Metabolic coupling between glia and neurons[J].J Neurosci，1996，16（3）：877-885.

[14]Leis J.A，Bekar L.K，Walz W.Potassium homeostasis in the ischemic brain[J].Glia，2005，50（4）：407-416.

[15]Petito C.K，Olarte J.P，Robert B，et al.Selective glial vulnerability following transient global ischemia in rat brain[J].J Neuropathol Exp Neurol，1998，57（3）：231-238.

[16]Yu A.C.H，Wong H.K，Yung H.M，et al.Ischemia-induced apoptosis in primary culture of astrocytes[J].Glia，2001，35（2）：121-130.

[17]Ito U，Hanyu S，Hakamata Y，et al.Ultrastructure of astrocytes associated with selective neuronal death of cerebral cortex after repeated ischemia[J].Acta Neurochir Suppl，1997，70：46-49.

[18]付學軍，褚曉凡，亓傳潔.脹亡-持續性局灶性腦缺血星形膠質細胞的死亡方式[J].中華神經醫學雜志，2005，4（10）：979-982.

[19]Cao X，Zhang Y，Zou L，et al.Persistent oxygen-glucose deprivation induces astrocytic death through two different pathways and calpain-mediated proteolysis of cytoskeletal proteins during astrocytic oncosis[J].Neurosci Lett，2010，479（2）：118-122.

[20]Verkman AS.More than just water channels：unexpected cellular roles of aquaporins[J].J Cell Sci，2005，118：3225-3232.

[21]Rash JE，Yasumura T，Hudson CS，et al.Direct immunogold labeling of aquaporin-4 in square arrays of astrocyte and ependymocyte plasma membranes in rat brain and spinal cord[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（20）：11981-11986.

[22]Klatzo I.Evolution of brain edema concepts[J].Acta Neurochir Suppl（Wien），1994，60：3-6.

[23]Manley GT，Fujimura M，Ma T，et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].Nat Med，2000，6（2）：159-163.

[24]Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn PD，et al.An alpha-syntrophindependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（4）：2106-2111.

[25]Yang B，Zador Z，Verkman A.S.Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling[J].J Biol Chem，2008，283（22）：15280-15286.

[26]Meng S，Qiao M，Lin L，et al.Correspondence of AQP4 expression and hypoxic–ischaemic brain oedema monitored by magnetic resonance imaging in the immature and juvenile rat[J].Eur J Neurosci，2004，19（8）：2261-2269.

[27]Yamamoto N，Sobue K，Miyachi T，et al.Differential regulation of aquaporin expression in astrocytes by protein kinase C[J].Brain Res Mol Brain Res，2001，95（1-2）：110-116.

[28]Lee M，Lee S.J，Choi H.J，et al.Regulation of AQP4 protein expression in rat brain astrocytes：role of P2X7 receptor activation[J].Brain Res，2008，1195：1-11.

[29]Kaur C，Sivakumar V，Zhang Y，et al.Hypoxia-induced astrocytic reaction and increased vascular permeability in the rat cerebellum[J].Glia，2006，54（8）：826-839.

[30]Taniguchi M，Yamashita T，Kumura E，et al.Induction of aquaporin-4 water channel mRNA after focal cerebral ischemia in rat[J].Brain Res Mol Brain Res，2000，78（1-2）：131-137.