多糖硫酸酯化修飾及其抗凝血作用研究進展

尹馨梓，張佩華，2，陳士國，葉興乾*

1浙江大學生物系統工程與食品科學學院農產品加工實驗室，杭州310058;

2浙江省質量檢測科學研究院，杭州310013

硫酸酯化多糖是一類單糖分子上羥基被硫酸根取代的多糖，也稱硫酸多糖或多糖硫酸酯。硫酸多糖具有廣泛的生物活性，除最主要的抗凝血［1］作用外，還具有抗腫瘤［2］、抗病毒［3］，抗HIV［4］活性等，而且大多無毒［5］，因而受到極大的關注。硫酸酯化多糖包括天然和化學修飾的硫酸多糖［6，7］，包括從海洋多糖，肝素，植物中提取的各種硫酸多糖以及人工合成的多糖硫酸酯。硫酸酯化多糖的化學結構對其生物活性有著重要的影響［8］，因而其構效關系在國內外得到重點關注和研究［9］。

抗凝血活性是硫酸多糖的一個非常重要的生物活性，近幾年硫酸多糖抗凝血作用的構效關系也成為熱點之一。本文就近幾年天然以及合成的硫酸多糖的修飾方法、多糖硫酸酯以及硫酸多糖的抗凝血活性及其影響因素、構效關系等方面進行綜述。

1 硫酸化方法

對不含有或者含有硫酸基量少的物質進行硫酸化修飾就是化學法硫酸化多糖的過程。硫酸化過程，即磺酸基團與多糖的羥基發生酯化反應的過程。整個反應體系主要包括酯化劑和溶劑兩部分。常用的酯化劑主要有:濃硫酸、氯磺酸、三氧化硫、二氧化硫和氧氣等。但是這些酯化劑存在共同的缺點:它們的酸性太強，在反應過程中會導致多糖分子鏈發生強烈的降解。為了降低多糖分子鏈的水解和降解，且同時提高多糖的溶解性，有機溶解常常搭配酯化劑使用。傳統常用的有機溶劑有:DMSO、DMF、吡啶、甲苯、三乙胺、甲酰胺等［11］，下面介紹一些常用的硫酸酯化的方法。

1.1 N(SO3Na)3 法［10］

以及亞硫酸氫鈉和亞硝酸鈉合成的近似中性的醋化劑N(SO3Na)3在水溶液中與多糖反應由E.F.Paschall 于1956 年首次使用，N(SO3Na)3被證實是一種溫和的硫酸酯化試劑，且發生的硫酸酯化反應相對不劇烈，引起的降解范圍較小，同時低污染、低消耗，因而最近得到廣泛關注。

1.2 氯磺酸-甲酰胺法［11，12］

氯磺酸-甲酰胺法是O’Neill，A.N.與1955 年首次使用的。主要步驟是將多糖懸浮于無水甲酰胺中，攪拌，在室溫下逐漸加入酯化試劑氯磺酸，反應結束后，用NaOH 中和除氨，透析，濃縮，乙醇沉淀，沉淀經干燥即得。此方法是一種較為理想的硫酸酯化方法，但是被證實可能引起多糖的部分降解。

1.3 氯磺酸-吡啶法［13，14］

將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入一定量的氯磺酸，燒瓶中出現大量淡黃色固體，然后加入多糖粉末，迅速將三頸瓶移人沸水浴中，恒溫攪拌1 h，冷至室溫，將反應液傾入冰水中，中和后加入乙醇，析出沉淀，將沉淀溶于水透析72小時，過濾，濾液經冷凍干燥后得多糖硫酸化產物。該方法硫酸酯化試劑廉價易得，硫酸酯化效果較好。

1.4 其他方法

其他的硫酸酯化方法的方法還包括三氧化硫-吡啶法［15］、三氧化硫-三甲胺鹽［16］，三氧化硫-DMF法［17，18］，濃硫酸法［19］等。

2 硫酸多糖的抗凝血活性

肝素是最早，也是已經比較廣泛地用于臨床的抗凝血劑［20］。但是研究顯示:肝素在具有抗凝血活性的同時，會產生許多不可預見的副作用［21］，如:抗血小板活性，可引發不正常的流血現象［22，23］;以及由于動物源提取，人畜間朊病毒、瘋牛病感染的幾率增加等［24，25］。肝素在抗凝血作用與分子結構的特異性、硫酸基含量以及負電性有關［26］。近年來，根據肝素抗凝血機理制備得到的硫酸多糖由于其低副作用，傳染疾病幾率小等的特點而受到廣泛的關注和研究。天然硫酸多糖和化學法硫酸化多糖都具有較好的抗凝血活性。

2.1 天然硫酸多糖

硫酸酯基及其負電性對抗凝血活性有著重要的影響，而海洋生物中的多糖含有豐富的硫酸酯基，是天然硫酸多糖最豐富最廣泛的來源。含有天然硫酸多糖的海洋生物包括海洋植物中的藻類(紅藻、褐藻、綠藻、水草)，海洋無脊椎動物中的海膽，海參，海鞘等。這些天然硫酸多糖抗凝血活性在過去的研究中都得到了不同程度的證明，海洋生物是抗凝血活性物質的良好來源［26，27］;海草中的一種硫酸多糖(SPSG)被證實也有良好的抗凝血活性［28］。APTT和PT 測試實驗表明，SPSG 具有顯著的抗凝血活性，且比試驗肝素APTT 高2.5 倍，這個數據首次證明了從海草上提取的硫酸多糖的生物活性。霞水母提取物對小鼠抗凝血作用也有影響［29］，有研究顯示，霞水母提取物能不同程度地延長小鼠體內凝血時間、出血時間和體外凝血時間，能顯著提高小鼠的APTT 和PT。近幾年來國內外同時也發現其他生物中含有天然硫酸多糖，實驗證明其也具有良好的抗凝血活性。陳士國［30］等對海參硫酸軟骨素和美國肉參進行了體外抗凝血活性分析。結果發現不同濃度的海參硫酸軟骨素樣品以及美國肉參均具有較強的抗凝血活性，兩個樣品的APTT 和TT 實驗延長時間與標準肝素相近，且無非正常的流血現象。

肝素是被應用最早也是最廣泛的抗凝血藥物，但是普通肝素具有一定副作用，針對此，將天然肝素一定程度降解得到低分子量肝素近幾年得到廣泛的關注和研究。有研究對低分子量進行制備，且分離出高活性高純度的低分子肝素，硫含量提高了0.828%［31］，抗凝血活性增強，因而減少用量，從而降低了副作用。水蛭中的也有抗凝血成分，提取結果發現正己烷、乙酸乙酯、水溶液提取部分均有不同程度的抗凝血藥理活性，乙酸乙酯部分的抗凝血效果最強［32］。刺松藻多糖也能顯著延長家兔血漿APTT、PT 和TT;顯著抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的家兔血小板聚集［33］。

2.2 化學法硫酸化多糖

有些具有抗凝血活性的多糖，在脫去硫酸根以后，活性也隨之消失或減弱。同時，也有些多糖因硫酸根的引入而明顯增強了其抗凝血活性。一些不具有硫酸基團的多糖，如甲殼素，瓜爾豆膠，魔芋多糖等在修飾后具有較好的抗凝血效果。有實驗表明，硫酸根對硫酸多糖生物活性的發揮起關鍵作用，尤其是抗凝血活性。

陳士國［34］等采用三氧化硫吡啶-二甲亞砜體系對北太平洋魷魚墨多糖(SIP)及其三乙胺鹽進行硫酸酯化。研究表明:硫酸酯化對魷魚墨多糖的單糖組成影響不大，但是分子量降低，硫酸酯化后，糖單元數與硫酸基的摩爾比約為3∶2。凝血活性分析表明，它具有較好的延長活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)的效果。而對比未硫酸酯化過的魷魚墨多糖(不含硫酸基團)的無明顯抗凝血活性，推斷得出化學法硫酸化修飾成功增加了抗凝血活性。Lihong Fan［35］等通過N(SO3Na)3在水中與果膠多糖進行反應，對其進行硫酸酯化，取得了反應的最優條件(反應pH 為6，反應溫度為60°C，反應時間12 h，亞硝酸鈉和果膠的摩爾質量比為2.5/190mol/g)，并獲得果膠硫酸酯。紅外光譜，核磁共振證明硫酸基成功結合上，活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)實驗證明樣品有良好的抗凝血活性。對可食用的白樹花真菌進行發酵，提取水溶性多糖，采用氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯化修飾，可以獲得水溶性的白樹花多糖硫酸酯。APTT 、TT 以及凝血因子活性均說明白樹花多糖硫酸酯具有明顯的抗凝血活性，僅在5 mg/L 的濃度下即可發揮效果，在10 mg/L 濃度時，相當于150U 肝素的抗凝血效果［36］。

除了加入硫酸根基團，還有其他化學修飾的方法可以增加其抗凝血活性。宋玉民［37］等:以甲苯二異氰酸酯(TDI)中的-NCO 基與納米金屬氧化物表面的羥基發生反應，得到改性納米金屬氧化物，并使其與肝素鈉進行接枝反應生成肝素雜化材料。肝素雜化材料的抗凝血時間和復鈣時間均比肝素鈉的要短，表明它的抗凝血性比肝素鈉的抗凝血性要弱一些;但比納米金屬氧化物和空白組的抗凝血時間和復鈣時間要長，說明肝素雜化材料的抗凝血性與其相比則有明顯的提高。

3 硫酸多糖的構效關系

多糖的生物大分子結構比蛋白質更為復雜，多糖主鏈和支鏈的性質以及高級結構影響多糖的生物學活性。多糖的一級結構是指糖基的組成、排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭物的構型及糖鏈有無分支，分支位置與長短等。二級三級四級結構是建立在一級結構上，所形成的各種氫鍵、聚合體、空間結構等等。所以硫酸多糖構效關系的研究主要集中在糖基組成、糖基的連接方式以及糖基與硫酸基的連接方式上。

機體的自身的抗凝功能主要依靠的抗凝物質是絲氨酸蛋白酶抑制物，包括抗凝血酶III(AT-III)，和肝素輔因子(HC II)［38］，兩者對凝血酶和凝血因子進行抑制，進而抑制凝血。多糖硫酸酯具有多負電荷特性，而AT-III 由于分子中存在賴氨酸和精氨酸殘基，有高密度的正電荷，二者可以非特異性結合，從而激活AT-III，因此一定的陰離子電子密度對抗凝血作用非常重要［39］;而HC II 主要通過誘導凝血酶與之形成1:1 穩定復合物，從而使凝血酶失去蛋白水解酶活性，硫酸皮膚素的參與下，可催化加快速度。硫酸多糖的結構與相關凝血物質等的特異性結合導致了不同的抗凝血效果，因而研究硫酸多糖與凝血物質的構效關系，作用機理在近些年來得到國際上的廣泛關注，成為研究的熱點。

3.1 多糖的單糖組成及糖苷鍵類型

主鏈的糖單元組成、糖苷鍵類型直接決定多糖的活性，支鏈的類型、聚合度、在多糖鏈上的分布及其取代度決定多糖活性的強弱。有研究表明多糖的活性與α 或β 構型無關，與單糖種類無關，但與糖苷鍵的構型有關，鄰近位置的硫酸基團也會導致構象發生變化［40］。對于(1～3)連接的多糖，6 位硫酸基的存在影響多糖的抗凝血活性，而對(1-4)連接的多糖硫酸基團的位置對多糖的活性卻沒有影響。Mao等［41］從一種綠藻提取到硫酸多糖，這種硫酸多糖基含量很高(主要是1，2 位連接的L-鼠李糖)，硫酸基團主要在C-3 和/或C-4 位，這與1991 年Maeda等［42］發現的M.nitidum 在組成上很相近，但是結構卻有著截然的不同，主要是鼠李糖連接方式的不同。研究發現，這種新發現的硫酸多糖與M. nitidum 的抑制凝血因子并不相同，且凝血效果相差很大。

3.2 多糖分子量

根據研究報道，硫酸多糖的分子量是抑制凝血級聯形成復雜的一個主要因素，對抗凝血活性有著重要影響［43］。低分子量肝素通過β 消除降解法從普通肝素中得到，經過對反應條件的優化，得到的低分子量肝素的分子量范圍:分子量小于2000 的占17.5%，分子量大于8000 的占71.1%［31］。實驗結果發現降解后的三種低分子量肝素與未修飾之前相比，IC50值分別降低了3.3、8.7 和2.4 倍，說明降解后，抗凝血活性大大增強了。然而一般情況下，對于硫酸多糖，分子量與抗凝效果呈正相關。然而，超高分子量可能限制硫酸果膠組分的擴散和吸收進入血液的過程。Thales R.Cipriani 等［43］對不同分子量的硫酸酯化果膠進行抗凝血活性的研究，結果表明，低分子量和高分子量的硫酸酯化果膠結構相似，都具有a (1→4)-linkedα-D-GalpA 結構，但高分子量硫酸酯化果膠的樣品抗凝血效果更好，并且副作用更小。而Lihong Fan 等［35］在制備了不同分子量的硫酸酯化果膠多糖(分別為16、20、23 KDa)后測定了它們的抗凝血活性。結果發現分子量為20 KDa 的硫酸酯化多糖的抗凝血效果最好，分子量再增加，則效果出現降低。

沈元［44］采用近似中性的酯化劑三磺酸鈉胺(N(SO3Na)3)與季銨化合物(QACS)反應，制備了季銨化合物硫酸酯(QACSS)。并對所得產物進行紅外及核磁表征，證明了QACSS 的結構。出其分子量分別為1.40 ×104，2.51 ×104 和3.80 ×104?？鼓钚詫嶒灲Y果表明，QACSS 的APPT，PT 及TT 值都高于正常值，說明QACSS 具有抗凝血活性;分子量為2.51 ×104 的QACSS 具有最好的抗凝血活性。

3.3 硫酸基含量及其取代度

硫酸基取代度的含義為每二糖單位中的硫酸基含量。實驗表明，多糖硫酸酯的作用與其取代度在一定范圍內呈正相關性。一般來說，硫酸根含量在每個糖殘基平均1.5～2.0 時最佳，因而發生雙硫取代反應對抗凝血活性的貢獻較大。同時，硫酸根取代度僅僅是一方面，其他因素如取代位置和特定基團對抗凝血活性也有重要影響［45］。低分子量的褐藻多糖硫酸酯(50 KDa)兼具良好的抗凝血活性和更弱的血小板激活作用［46］。

Hatem Majdoub［47］通過聚氨酯泡沫超濾從螺旋藻培養基中提取的粗多糖組分并用DEAE-纖維素陰離子交換層析，得到多糖PUF1 和PUF2。測定硫酸根含量的結果表明PUF2 的硫酸根含量(20%)大于原粗螺旋藻培養基的胞外多糖(5%)，測定抗凝血活性的實驗結果表明相比與PUF1 和原未提取的粗螺旋藻培養基的胞外多糖，PUF2 有很高的活性，甚至比硫酸皮膚素的抗凝血活性高。羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯通過羧甲基化、磺化等進行化學修飾后，抗凝血實驗表明磺化取代度大于0.35 的羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯能拮抗內源性凝血途徑，并且在一定范圍內，羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯的抗凝血活性隨著羧甲基取代度、磺化取代度和分子量的增加而增加［48］。

3.4 硫酸基的取代位置

不同來源的硫酸多糖抗凝血活性有很大的差別，這不僅在于多糖的種類不同，而且和硫酸基在多糖的取代位置有很大的關系。Mulloy 等［49］對硫酸軟骨素通過核磁共振分析發現，保持硫酸基取代度不變，將硫酸軟骨素B C-4 位上的硫酸基變為C-6位硫酸基，其抗凝血活性完全喪失，實驗表明C-4 位上的硫酸基發揮著抗凝血作用。

Mour?o PA.［50］在對褐藻的研究中發現2，4-二硫酸基團在抗血栓調節過程中有增強效果的作用。(從2-sulfated，3-linked α-L-fucans 到2，4-disulfated α-L-fucans 硫酸基含量增加了1.8 倍，活性卻增加了38 倍);且特定的硫酸基結合位點決定了同血漿中絲氨酸蛋白酶抑制劑特異性結合。而單一的在3位連接α-L-巖藻糖位發生C-4 位硫酸根的修飾對肝素輔因子II 介導的凝血酶抑制非常重要，C-2 位硫酸根的修飾卻有破壞抗凝血作用的性質。陳士國等［34］采用紅外光譜和一維核磁技術對硫酸酯化后多糖的結構進行了分析，結果表明，硫酸酯化主要發生在N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的4、6 位上。進一步的抗凝血實驗表明，樣品的抗凝血效果很顯著。Roberto［51］研究了過硫酸化的硫酸軟骨素和巖藻糖基化的硫酸軟骨素對凝血系統的作。結果發現過硫酸化的硫酸軟骨素是在葡萄糖醛酸殘基的2-和3-位發生硫酸化;同樣，在半乳糖醛酸殘基上的4-和6-位也發生了不同程度的硫酸化，其他硫酸基團被化學硫酸化反應結合上。而巖藻糖基化的硫酸軟骨素由海參中提取，它的主干部分和硫酸軟骨素很接近，支鏈部分還有2，4-二硫酸巖藻糖殘基。巖藻糖基化的硫酸軟骨素的凝血效果比過硫酸化的硫酸軟骨素高很多，因而硫酸根的取代位置對其抗凝血活性有著重要的影響。

4 結論與展望

硫酸多糖的化學結構是其生物活性的基礎。其廣泛的來源和豐富的種類使其結構的研究成為研究的重點和熱點?，F在國內外對硫酸多糖的探索集中在兩方面，一是尋找到新的，更廣泛，效用更高，副作用更小的來源，同時也在尋找修飾效果更好副作用更小的硫酸酯化方法;一方面對抗凝血活性良好、來源廣泛的硫酸多糖進行機理的進一步探索。國內外對硫酸多糖的結構和功能之間的構效關系的探索還在繼續。硫酸多糖的作用位點、活性中心、介導物質、作用凝血因子及其可能帶來一些凝血方面的副作用需要進一步的研究，這對更有重點和目的性地應用硫酸多糖帶來技術支持。隨著研究水平和技術的提高，更多深入、清楚的機理研究將為硫酸多糖的結構功能關系奠定更為深的基礎，也為硫酸多糖的廣泛應用提供更堅實的依據。

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