DNA主動去甲基化相關通路的研究進展

金巧智 綜述，蔡志毅 審校

(1.溫州醫學院第一臨床醫學院，浙江 溫州 325000;2.臺州市立醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 臺州 318000)

對于DNA去甲基化的研究以往都是以DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)為靶向分子，通過抑制DNMT來恢復抑癌基因的功能，從而達到治療腫瘤的目的。去甲基化藥物就是通過抑制DNMT的活性使復制后的DNA不能再次甲基化，從而導致所有等位基因表現為去甲基化，使抑癌基因得以恢復表達，抑制腫瘤的生長。雖然去甲基化藥物的出現將腫瘤的治療帶到了一個新的高度，但是仍有很多問題亟待解決，比如DNA去甲基化的確切機制及其靶向特異性。目前研究發現DNA去甲基化主要有兩種方式:一種是在原生殖細胞和早期胚胎中都可以發生的主動DNA去甲基化[1]，這一過程不依賴于DNA復制，受酶的催化，使5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)轉化為未甲基化的胞嘧啶;另一種是通過與復制相關的過程發生的被動DNA去甲基化[2]，即在DNA復制時，DNA甲基化模式的維持受到干擾，沒有保留原有甲基化模式，隨著復制的進行，甲基化的CpG島被“稀釋”，導致DNA去甲基化。

盡管在很多細胞進程中都存在DNA主動去甲基化，但是關于主動去甲基化的潛在機制仍存在很多爭論[3]。目前研究發現DNA主動去甲基化可能涉及到的通路有6個，即5mC脫氨基化與BER偶聯通路、堿基切除修復(base excision repair，BER)通路、5mC甲基團脫氫通路、核苷切除修復(nucleoside resection repair，NER)通路、水解反應直接去除甲基團、5mC氧化去甲基化[3-5]。與這些通路相關的酶和因子有:胞嘧啶脫氨酶:AID，APOBEC1[6-7];TET 蛋白:TET1，TET2 等[8-9];延伸復合物蛋白:ELP1，ELP2等[10];堿基切除修復蛋白:RNF4，TDG 等[11-13];核苷酸切除酶:GADD45a，GADD45b[14-15];DNA甲基轉移酶:DNMT3a，DNMT3b;DNA 糖基化酶:EME，DML2 等[16-17]。但其中哪個或哪些具有真正的DNA去甲基化活性尚待驗證。本文綜述最新文獻資料，介紹其中主要通路及其相關的酶和因子。

一、5mC脫氨基偶聯BER通路與AID蛋白

AID(activation induced deaminase)蛋白在 B淋巴細胞免疫球蛋白基因的種類轉變重組(species change restructuring，CSR)和體細胞超突變(somatic mutations，SHM)中發揮重要作用[18]，能使5mC脫氨基變為T，造成T/G錯配，在卵母細胞、胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)、胚胎生殖細胞和原生殖細胞(primordial germ cells，PGC)的DNA去甲基化中也起重要作用，AID的缺失會阻遏DNA去甲基化。利用重亞硫酸鹽新一代測序技術繪制的13.5日齡PGC的全基因組甲基化圖譜，證明活化誘導AID的缺失會影響PGC 全基因組甲基化消除[6]。Popp 等[6]研究還發現，AID完成對5mC的脫氨基修飾后，留下的T/G錯配可激活DNA修復通路，其中倍受關注的是AID與BER偶聯的DNA去甲基化通路。Hajkova等[13]也發現PGC全基因組去甲基化過程可激活DNA修復通路，他們在小鼠PGC中發現，XRCC-1和 PARP-1與染色質結合的同時，DNA甲基化水平降低，表明正在發生去甲基化的PGC中有BER通路參與。BER通路中發揮部分作用的DNA糖苷酶可以逆轉AID的脫氨基作用導致T/G錯配。在斑馬魚中AID和甲基化CpG結合蛋白家族成員中的MBD4一起，促進DNA去甲基化[12]。據報道，Aid-/-小鼠PGC基因組甲基化水平高于野生型，Aid基因缺失主要影響內含子、轉座子以及部分外顯子的去甲基化，而啟動子甲基化水平與野生型相當。但是Aid-/-的PGC中仍發生一定程度的去甲基化[19]，暗示AID對整個基因組的去甲基化作用是有限的?；蛘哒f其促進去甲基化作用可能存在序列特異性。最近的研究報道，AID缺失會干擾總DNA的去甲基化，在ES+體細胞聚合物中，AID參與像 OCT4或NANOG這些多潛能細胞的去甲基化[7]。利用RNA干擾技術阻斷人類成纖維細胞和小鼠ESC中的AID后，兩者融合形成的異核體中多能性相關基因Oct4和Nanog的啟動子處于甲基化狀態，使Oct4和Nanog基因表達受到限制[20]，表明AID可能在體細胞DNA甲基化再編程及其多能性誘導過程中起重要作用。

二、BER 通路與 TET、Apobec 1、TDG蛋白

TET(ten eleven translocation)蛋白被認為是一種候選DNA去甲基化酶，Tahiliani等[8]用JBP(base J binding protein，存在于錐體蟲屬中，可對胸腺嘧啶進行羥基化修飾)家族蛋白的酶活結構域進行了反復的序列比對，找到了TET1、TET2和TET3。TET1是一種Fe2+依賴性的5mC加氧酶，并預測人類TET1蛋白具有5mC羥基化酶活性，能促使DNA上的5mC轉變為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)。他們通過薄層色譜法(TLC)、質譜分析法(MC)等一系列生化實驗以及過表達，RNAi等細胞學實驗證實了其預測。同期發表的另一篇文章[21]在機體內也發現了5hmC的存在，從側面也印證了這一研究。在小鼠上做的進一步研究已經證實3種TET家族成員能夠使5mC轉變為5hmC，通過對敲除TET1的小鼠的研究證實，這種蛋白在早期胚胎發育過程中，對于保持胚胎干細胞的多能性具有潛在的作用[9]。在體外培養的小鼠 ESC中發現，TET1通過將5mC轉化為5hmC調節DNA甲基化水平，使Nanog基因保持激活狀態，從而維持ESC的多能性[15]。同樣，在人胚腎細胞HEK293細胞系和小鼠ESC中也發現TET1的5mC修飾作用，并且發現敲除TET1能導致5hmC水平下降[14]。在胚胎干細胞中，TET使5mC轉變為5hmC的生物學過程首先發生在主動轉錄基因，Tet1蛋白不僅能調控富含CpG啟動子區的DNA甲基化水平，而且能促進干細胞中與多能性相關的因子的轉錄，以及參與多梳靶向(具有靶向作用的大分子復合物)的發育調控因子的抑制，而且與基因的轉錄增加有關[22-23]。在最新的研究中，宋洪軍等[24]將小鼠分為電休克治療(electric shock therapy，ECT)樣電刺激處理組及對照組，然后利用遺傳工具結合聚合酶鏈反應(PCR)技術對來自這些小鼠大腦組織細胞中的基因組微小區域進行了擴增，隨后對這些DNA片段上胞嘧啶狀態進行了比較分析。利用先進的基因測序技術，研究人員分析了2組小鼠腦細胞中DNA特殊區域的胞嘧啶甲基化狀態(包括普通胞嘧啶、甲基化胞嘧啶、羥甲基化胞嘧啶)。研究結果表明ECT確實誘導了去甲基化，而TET1是這一過程的關鍵性作用因子，同時提到了另一種脫氨酶Apobec1(apolipoprotein B RNA-editing catalytic component-1)，TET1 使5mC轉變為5hmC，而Apobec1則進一步促使羥基化胞嘧啶轉變為胞嘧啶，同時發現5hmC的去甲基化需要BER通路的參與。而徐國良等[25]研究發現，無論是體外的細胞還是培養的細胞，DNA第5種堿基5mC、第6種堿基5hmC可以進一步形成第7種堿基 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。這種新的修飾堿基會被自動識別出來，并依靠胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase，TDG)從基因組中切除，再通過DNA的剪切修復，替換為沒有修飾成分的胞嘧啶。為了弄清5hmC的去甲基化機制，Wossidlo等[26]將小鼠合子中的父源基因組DNA主動去甲基化現象與DNA修復機制聯系到了一起，通過觀察合子內甲基化水平的動態變化以及DNA復制、DNA斷裂、DNA修復發生的精確時間，發現DNA鏈斷裂標記(γH2A.X)、BER通路標記(PARP-1)和DNA甲基化水平的降低都在合子雄性原核形成的第三個階段(PN3期)開始出現，暗示合子中的DNA主動去甲基化與BER通路存在聯系。在PN3期雄性原核中能檢測到XRCC-1(BER通路核心組件)和PARP-1信號，但幾乎檢測不到ERCC1(NER通路核心組件)和XPA(NER通路組件之一)信號[13]，進一步說明合子中DNA主動去甲基化的DNA修復可能通過BER通路。

三、5mC中的甲基脫氫通路與ELP3蛋白

ELP(elongator complex protein)蛋白是1999年Otero等[27]在研究酵母RNA聚合酶Ⅱ(RNA PⅡ)復合物各成分的性質時，從酵母染色質的RNA PⅡ/DNA/RNA三元復合物中分離得到的，它與轉錄延伸過程中磷酸化的RNA PⅡ結合。ELP由6個亞基組成的2個亞單位構成，Elp1/2/3構成較大的亞單位，Elp4/5/6構成較小的亞單位。Elp3亞基是中心亞基，起著將其他亞基組裝成整體的作用[28]。Elp亞基中有一個鐵硫簇的結構域，能夠結合S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine，SAM)，這在去甲基化反應中發揮關鍵作用。ELP3蛋白在合子DNA主動去甲基化過程中起重要作用[3，10]，被敲除后阻礙合子中父源DNA的去甲基化[10]。在受精前向MⅡ期卵母細胞內注射編碼ELP3結構域突變體mRNA，發現ELP3中含有鐵硫簇的S-腺苷甲硫氨酸殘基結構域突變可阻止父源DNA的去甲基化[10]。生物信息學證據表明，SAM殘基超家族蛋白催化包括DNA甲基化在內的許多反應[29]。ELP3的 SAM殘基結構域可利用SAM產生5'-脫氧腺苷殘基，使5mC甲基團脫氫，進而發生一系列生化反應而生成5hmC并最終轉化為未甲基化胞嘧啶[3]。然而，由ELP3介導的去甲基化尚缺乏直接證據，它所催化的去甲基化具體生化反應也有待進一步驗證。

四、NER通路與Gadd45a蛋白

Gadd45(Growth arrest DNA-damage-inducible protein 45)蛋白家族包括 Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g，它們的序列高度保守并且是細胞應激反應的關鍵因子[30]。其中，Gadd45a在細胞增殖、DNA修復、細胞周期和細胞凋亡中發揮重要作用[31-32]。Barreto等[33]研究發現 Gadd45a 在非洲爪蟾蜍卵母細胞的主動去甲基化進程中發揮著重要作用，Rai等[12]在對斑馬魚受精卵的研究中也發現Gadd45a能促進DNA的主動去甲基化。最新的一項研究揭示了成骨干細胞終端分化中存在DNA主動去甲基化調控方式，而且Gadd45a在該過程中發揮了關鍵作用[34]。該研究以成骨分化間充質干細胞為實驗模型，研究發現，Gadd45a介導的成骨基因去甲基化調控主要發生于啟動子的中等密度區，而非通常認為的具有較高密度的CpG島[35-36]，而且Gadd45a介導的主動去甲基化主要發生在若干特定的CpG位點上，如Dlx5的-913和-800、Runx2的-820和-808、BGP的-1003以及Osterix的 -727和-632 CpG位點，提出在DNA主動去甲基化過程中可能存在一種位點特異性去甲基化機制。研究還發現，Gadd45a通過與啟動子直接結合而發揮作用，它對成骨基因的主動去甲基化調控可能是通過NER途徑實現的。

五、展望

以TET家族為代表的5mC羥化酶的發現，使TET在DNA去甲基化的過程中發揮的作用受到越來越多的關注。已經知道TET1催化5mC羥基化是DNA主動去甲基化的關鍵一步，去甲基化是由5mC的修飾開始，而不是直接的移除其甲基團。雖然很多的研究表明在動植物中廣泛的存在DNA主動去甲基化，但其潛在的分子機制還有待繼續深入研究。

在研究DNA去甲基化機制的同時，DNA主動去甲基化的靶向作用機制也開始受到了關注[1]。有研究結果顯示，DNMT抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)在治療腫瘤的同時也增加了腫瘤浸潤、轉移的危險性[37]。在乳腺癌細胞系MCF-7和2R-75-1中加入5-aza-CdR后，腫瘤細胞增殖減低、抑癌基因RSSSF1A表達恢復、細胞周期改變、裸鼠體內腫瘤生長速度減慢。但同時也誘導了6種原浸潤、原轉移基因，使它們的啟動子發生去甲基化，產生基因不穩定性。因此，再深入研究DNA去甲基化機制的同時，如何使去甲基化更具特異性和靶向性，盡可能降低對其他方面的負面影響也將成為今后去甲基化研究的目標。

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