響應面法優化紅雪茶中類胡蘿卜素的提取工藝

楊青松，趙 艷，王 瑩，熊 勇，鄧芳軼

(1.云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明650500; 2.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650500; 3.云南農業大學基礎與信息工程學院，云南昆明650201; 4.云南省食品藥品檢驗所化學室，云南昆明650011)

紅雪茶為地衣類梅衣科(Parmeliaceae)金絲屬(Lethariella(Mot.)Krog.)2種不同地衣的統稱，即金絲刷(L.cladoniioides)和金絲帶(L.zahlbruckneri)［1-2］。紅雪茶由于其地衣體為橘紅色至土紅色，開水沖泡后色澤紅亮，猶如紅葡萄酒色，故在滇西北又稱為鹿心雪茶?，F代醫學研究表明，紅雪茶具有清熱、抗炎、抗疲勞、抗輻射等作用［3-6］，具有鎮靜、消炎、止痛的功能［7］。據考證，少數民族，尤其是藏族將其作為茶飲具有悠久的歷史［1］，是一種天然、無污染、無毒副作用的野生飲品，具有較高的開發價值。植物源天然色素由于其色調自然、安全性高，同時大多數兼具營養和藥理作用，目前已逐漸替代人工合成色素［8-9］。對天然色素的開發和應用成為行業熱點，而類胡蘿卜素以其特殊生理功能和藥理功能一直是研究的熱點［10-11］。紅雪茶色素是一種天然食用色素，可用于食品，醫藥等行業中［12］。為充分利用這一資源，本文基于響應面分析法，建立合適的BBD實驗模型，對丙酮提取紅雪茶類胡蘿卜素工藝在料液比、提取時間、提取溫度3個因素上進行優化，最終獲得其最佳提取工藝，為日后紅雪茶深加工等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅雪茶 2011年9月購自云南省香格里拉縣山原土特產品經銷店;丙酮 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司;蒸餾水 實驗室自行制備。

FA1204B電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;DFT-100手提式小型植物試樣粉碎機 北京科思佳科技有限責任公司;1650F紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品類胡蘿卜素的提取 使用小型植物試樣粉碎機粉碎樣品，過100目篩，用丙酮浸提，過濾后，濾液濃縮，獲得類胡蘿卜素提取液。

1.2.2 樣品類胡蘿卜素含量的測定 浸提液過濾后，以丙酮為參比液，使用紫外可見分光光度計在最大吸收波長445nm，進行比色法測定吸光值。

依照中華人民共和國國家標準《水果、蔬菜汁類胡蘿卜素全量的測定GB12291-90》計算提取液類胡蘿卜素含量:

其中:A為提取液在最大吸收波長下的吸光值; 20為換算系數。

再根據式(1)以式(2)計算類胡蘿卜素的實際含量:

其中:V為提取液樣品的體積(m L);F為提取液樣品在測定吸光值時的稀釋倍數;M為紅雪茶樣品干粉質量(g)。

1.2.3 單因素實驗 選取料液比(g/m L)、提取溫度(℃)、提取時間(min)3個影響因素，考察這3個因素對類胡蘿卜素提取量的影響。

1.2.4 響應面實驗 本實驗采用 Design-Expert7.0軟件中的中心組合實驗(Box-Behnken Design，BBD)原理，根據單因素實驗的結果，確定響應面的實驗方案。選取料液比、提取溫度、提取時間為自變量，以紅雪茶類胡蘿卜素提取液的吸光值為響應值，進行三因素三水平響應面分析實驗，優化其提取工藝條件。根據單因素實驗結果，設計了響應面實驗因素水平，見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 料液比對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響 稱取紅雪茶粉1.00g，分別設定料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7(g/m L)，在30℃條件下提取30min，實驗結果如圖1所示。

表1 響應面實驗因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface analysis

圖1 料液比對類胡蘿卜素提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction of carotenoids

由圖1可知，隨著液體比例的增加，類胡蘿卜素的提取量先小幅度上升，當料液比到達1∶3時，提取量達到最大。但隨液體比例持續增加，類胡蘿卜素的提取量逐漸呈現下降趨勢。因此選擇料液比1∶2、1∶3、1∶4作為紅雪茶類胡蘿卜素提取的響應面分析料液比3水平。

2.1.2 提取時間對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響

稱取紅雪茶粉1.00g，提取時間分別設定為10、20、30、40、50、60m in，在料液比1∶3(g/m L)、溫度30℃條件下浸提，結果見圖2。

圖2 提取時間對類胡蘿卜素提取的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of carotenoids

由圖2可知，提取時間10～20m in，類胡蘿卜素的提取量變化不明顯;當提取時間達到30m in時，提取量明顯增加，并達到最大值。隨著提取時間延長，類胡蘿卜素的提取量逐漸降低，可能是因為隨著時間的延長，丙酮揮發越明顯。因此，選擇20、30、40m in作為類胡蘿卜素的響應面分析提取時間3水平。

2.1.3 提取溫度對紅雪茶類胡蘿卜素得率的影響 稱取紅雪茶粉1.00g，提取溫度分別設為25、35、45、55、65、75℃，在料液比1∶3(g/m L)條件下浸提30m in，實驗結果如圖3所示。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis for regression model

圖3 提取溫度對類胡蘿卜素提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of carotenoids

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，類胡蘿卜素的提取量有明顯的增加，當溫度到達55℃時，提取量最大。提取溫度繼續增加，類胡蘿卜素的提取量有小幅度的降低，這可能是浸提溫度過高，導致溶劑揮發損失所致。因此，選擇45、55、65℃作為類胡蘿卜素提取的響應面分析溫度3水平。

2.2 響應面優化提取工藝參數

2.2.1 響應面法優化實驗結果 采用Box-Behnken實驗設計對紅雪茶類胡蘿卜素提取條件進行3因素3水平的響應面分析實驗，結果見表2。

運用Design expert7.0軟件對實驗點的響應值進行回歸分析，結果見表3。

以紅雪茶類胡蘿卜素提取液的吸光值為響應值，得到紅雪茶類胡蘿卜素對自變量X1(料液比)、X2(提取溫度)、X3(提取時間)的回歸方程:

表3中模型項p值為0.0002，該值小于0.01，說明該模型回歸極顯著，可用于紅雪茶類胡蘿卜素的實驗設計?；貧w方程的相關系數R2=0.9664與決定系數為R=0.9233相差不大，表明回歸方程的擬合度好，失擬小，可用該回歸方程優化紅雪茶類胡蘿卜素的提取工藝。同時表3中的 p值表明，方程中X1X2、X2X3、X、X對類胡蘿卜素提取液的吸光值有極顯著影響。失擬項p值為0.2776，說明無顯著性影響，說明數據中沒有異常點，模型適當，不需要引入更高次數的項。

表2 響應面實驗設計及結果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.2.2 響應面直觀分析 根據回歸方程，獲得料液比、提取溫度和提取時間兩兩相互作用對類胡蘿卜素提取量的影響，結果見圖4。

圖4 各兩因素交互作用的響應曲面圖Fig.4 Response surface and contour plots of cross-interaction between each two factors

圖4a中響應面的坡度很陡，可以得出料液比和提取溫度的交互影響對類胡蘿卜素的提取有顯著影響;溫度軸的等高線變化密集，料液比軸的等高線變化稀疏，所以料液比對響應值峰值的影響較提取溫度大。圖4b中響應面的坡度較陡，可以得出提取時間和料液比的交互影響對類胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中料液比對響應值的影響大于提取時間。圖4c中響應面的坡度較陡，可以得出提取溫度和提取時間的交互影響對類胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中提取溫度對響應值的影響大于提取時間。故對紅雪茶類胡蘿卜素提取量的影響大小順序為料液比(X1)＞提取溫度(X2)＞提取時間(X3)，其中料液比的影響極顯著。

通過Design-Expert 7.0軟件分析，可以獲得紅雪茶類胡蘿卜素的最佳條件是在料液比為1∶3.07，溫度51.45℃，提取時間20.00min時，紅雪茶類胡蘿卜素提取量的預測吸光值為0.3794，理論類胡蘿卜素提取量為23.295μg/g。采用最優條件進行實驗驗證，實際測得類胡蘿卜素提取條件為料液比1∶3，提取溫度52℃，提取時間20m in，紅雪茶類胡蘿卜素提取量的吸光值平均為 0.3682，類胡蘿卜素提取量達到22.092μg/g，實際值與理論值的相對誤差較小，說明該實驗通過響應面法優化后得到的紅雪茶類胡蘿卜素提取條件準確、可靠。

3 結論

類胡蘿卜素在自然界中廣泛存在，具有特殊的生理功能和藥理功能，對人類的健康非常重要。但由于人類自身無法合成類胡蘿卜素，所以類胡蘿卜素的制備顯得很重要。目前制備天然的類胡蘿卜素常用的方法有:有機溶劑提取法、酶反應法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等［13］。其中后4種提取法都極大的提高了類胡蘿卜素提取率［14-17］，如張衛強等［14］應用微波輻射萃取番茄紅素，在最佳的工藝條件下，色素提取率為97.56%。熊犍等［15］采用超聲輻射提取玉米類胡蘿卜素，得到的類胡蘿卜素的濃度是無超聲輻射時的16.25倍。但酶反應法和超臨界流體萃取法儀器裝置復雜，不利于推廣應用。而微波輔助提取法和超聲波輔助提取法則是以有機溶劑提取法為基礎的。因此對常規有機溶劑提取法工藝優化是提高類胡蘿卜素提取率的基礎。

本研究通過單因素實驗和響應面實驗，基于常規有機溶劑提取法對紅雪茶類胡蘿卜素提取工藝進行優化，優化后得到的紅雪茶類胡蘿卜素提取最佳工藝條件為:料液比1∶3(g/m L)、提取溫度52℃、提取時間20min，在該條件下類胡蘿卜素提取液的吸光值為0.3682，實際獲取紅雪茶類胡蘿卜素22.092μg/g，與預測值接近。該實驗獲得的優化提取條件，能有效提高紅雪茶類胡蘿卜素的提取量，為今后的開發利用提供一定的理論參考。

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