不同種培養基對體外誘導免疫細胞的生物活性及細胞毒作用

王志爽，李新靈，邵曉楓，任 峰

（1.天津斯坦姆再生醫學技術研究開發中心，天津300384；2.中國醫學科學院血液學研究所，天津300020）

關于腫瘤的治療傳統方法如外科手術、放療、化療常常無法完全清除轉移的惡性腫瘤細胞。過繼細胞免疫治療是治療腫瘤的一種重要方法，作用原理主要是取出腫瘤患者體內部分有潛力的免疫細胞，由多種免疫因子刺激誘導，經過體外的干預，擴增其數量，激活和強化其功能，并教會它們如何識別機體內的異常細胞，如惡性腫瘤細胞或者病毒感染細胞，然后再回輸到患者自己體內。其殺傷機制表現為直接殺傷作用和免疫效應細胞參與的間接殺傷作用。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer,CIK）是將人血單個核細胞在體外用多種細胞因子[如抗CD3單克隆抗體（CD3M cAb）、IL-2、IFN-γ等]共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞群。其兼具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和自然殺傷（NK）細胞的非主要組織相容性復合體（MHC）限制性殺瘤特點[1-2]。培養基作為細胞培養中的主要載體，對誘導殺傷細胞的各種生物活性指標起到至關重要的作用，對于免疫治療的推廣應用有重要作用。在本實驗中，筆者通過運用多種培養基，比較培養出的細胞因子誘導殺傷細胞在體外增殖能力、殺傷活性、免疫表型變化及分泌細胞因子水平，旨在為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD3McAb、IL-2、IFN-γ、MD-CMSTM-N培養基、細胞處理試劑盒均為天津美德太平洋科技有限公司產品，AIM-V培養基為美國Gibco公司產品，RPMI 1640培養基為TaKaRa公司產品，MTT（噻唑鹽）為Sigma公司產品，FITC標記的小鼠抗人CD3，PE標記的小鼠抗人CD8、CD56及相應的同型對照購于美國BD公司。檢測細胞因子IFN-γ的ELISA試劑盒均購自上海滬宇生物科技有限公司。

1.2 靶細胞來源 BJAB為人B淋巴瘤細胞株，K562為人紅白血病細胞，均引自中國醫學科學院血液學研究所。

1.3 方法

1.3.1 CIK細胞的培養擴增 采集健康人外周血，將采好血液離心2300r/min 8min，上層血漿吸出轉入另一離心管中，此血漿放置水浴鍋中56℃，30min滅活，1800r/min離心8min，將處理好的上清轉入另一離心管中放置4℃備用。用細胞處理試劑盒分得單個核細胞，分別用RPMI 1640、MD-CM-STM-N和AIM-V在培養瓶內培養，每組細胞數為2×107。每組40mL培養基內含CD3McAb 5μg/mL，IFN-γ 1000U/mL，rhIL-21000U/mL，5%自體血清，置于飽和濕度、37℃、5.0%CO2培養箱中培養，第3天添加新鮮培養液，補充CD3McAb、IFN-γ、rhIL-2用量同前，此后每3d添加新鮮培養基，補加IFN-γ用量相同，IL-2用量減半。

1.3.2 細胞增殖能力測定 在細胞培養的第0、4、7、10、13和15天分別用臺盼藍染色法計數所培養的細胞，并在鏡下觀察形態。

1.3.3 細胞免疫表型分析 用流式細胞儀檢測（Beckman-coulter EPICS-XL）CIK細胞的免疫表型，分別在第0、6、10和15天收集5×106細胞。

1.3.4 細胞毒活性檢測 以不同效靶比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例放入96孔板，另設單獨靶細胞及效應細胞孔，每組設4個復孔，置37℃、5.0%CO2培養箱中培養48h，按文獻[3]的MTT法測殺傷活性。

殺傷活性（%）=[靶細胞OD值-（效應細胞OD值-實驗組OD值）]/靶細胞OD值×100%

1.3.5 細胞因子的測定 分別取培養第0、4、9、13、 16天的CIK細胞以1×106/mL接種于24孔板中，充分洗滌后收集上清，用ELISA雙抗夾心法，按試劑盒說明檢測培養上清中的IFN-γ的分泌水平。

2 結果

2.1 增殖能力比較 實驗表明，在培養第0天單個核細胞光鏡下呈圓形，大小均勻，前3天3組均無明顯形態變化，數量無明顯變化可能有微量減少。到第4～7天進入生長期，并有集落出現，但RPMI 1640組集落相對較少，3種培養條件下增長趨勢無明顯區別，第10～13天達到生長高峰，RPMI1640增長趨勢明顯不如其余兩組。最終，由2×107個細胞，RPMI1640組增殖1.6×109；MD-CM-STM-N組增殖至2.2×109；AIM-V組增殖至1.8×109。MD-CMSTM-N擴增倍數為（108.75±9.04）倍，AIM-V擴增倍數為（91±5.96）倍，RPMI 1640擴增倍數（78±3.14）倍，3組差異具有統計學意義（P<0.05，圖1）。

圖1 培養時間與增殖倍數關系(%，±s)Fig 1 Relationship between cultured time and proliferation multiple(%，±s)

2.2 細胞免疫表型的分析 比較3種培養條件下檢測CD3+、CD8+、CD3+CD56+這3種CIK細胞重要表型指標表達情況，結果表明隨著培養時間延長，CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞的比例兩種無血清培養基優勢明顯高于RPMI 1640組（P<0.05，表1～3）。而且AIM-V表現出前期表達效率高的特點，而MD-CM-STM-N則在最終表達效率較高。

表1 3種培養基CD3細胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 1 The CD3cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表1 3種培養基CD3細胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 1 The CD3cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

時間CD3+ D0D6D15RPMI164055.26±3.2282.70±3.1291.52±4.73MD-CM-STM-N 55.26±3.2289.51±2.10* 98.52±3.56* AIM-V 55.26±3.2293.01±3.22* 96.18±1.67*

表2 3種培養基CD8細胞表型的比較(±s,%,n=3)Tab 2 The CD8cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表2 3種培養基CD8細胞表型的比較(±s,%,n=3)Tab 2 The CD8cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

時間D0D6D15RPMI164021.27±4.3138.36±4.2452.28±5.12CD3+CD8+ MD-CM-STM-N 21.27±4.3138.92±2.3270.22±3.98* AIM-V 21.27±4.3143.87±4.0661.81±2.55*

2.3 殺傷活性 將3組細胞分別作為效應細胞，對BJAB及K562在不同效靶比下進行殺傷實驗，結果表明3組細胞均有殺傷活性，并且隨著效靶比的提高殺傷效率也隨之增強，但相同效靶比下細胞毒性強度不同，MD-CM-STM-N和AIM-V組直接無顯著差距但均高于RPMI1640組，尤其在高效靶比下差距明顯（表4）。

表3 3種培養基CD56細胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 3 The CD56cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

表3 3種培養基CD56細胞表型比較(±s,%,n=3)Tab 3 The CD56cell phenotypes in 3different culture mediums (±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05，**P<0.01

時間D0D6D15RPMI16401.92±1.015.72±1.5511.27±2.01CD3+CD56+ MD-CM-STM-N 1.92±1.019.58±2.3721.52±3.32** AIM-V 1.92±1.0112.81±1.58* 25.60±2.18**

表4 3種培養基對瘤細胞殺傷活性(±s,%,n=3)Tab 4 Killing activities on tumour cells by 3different culture mediums（±s,%,n=3)

表4 3種培養基對瘤細胞殺傷活性(±s,%,n=3)Tab 4 Killing activities on tumour cells by 3different culture mediums（±s,%,n=3)

與RPMI 1640組值相比，*P<0.05

BJAB E/T 5:110∶120∶140∶1RPMI 164013.12±2.1221.3±1.2133.86±2.0352.70±2.18MD-CM-STM-N 19.11±3.1232.76±0.9640.28±2.33* 61.25±5.16* AIM-V 21.12±4.1428.13±2.3139.97±2.7857.96±2.23RPMI 164010.16±1.9515.28±3.6027.61±4.0140.12±2.01K562MD-CM-STM-N 14.17±2.2120.38±3.1334.81±3.14* 53.2±2.78* AIM-V 16.19±3.1523.60±2.6134.92±2.08* 52.56±3.13*

2.4 細胞分泌IFN-γ能力測定 實驗發現，3種培養基培養細胞均分泌IFN-γ，第4天RPMI 1640組達到分泌最高峰，其余兩組也接近最高值略低于RPMI 1640組，但MD-CM-STM-N和AIM-V培養細胞分泌因子有相對穩定的高強度分泌時期（圖2）。

圖2 3 種培養基培養細胞IFN-γ分泌比較Fig 2 IFN-γ secretion of cells in 3different culture mediums

3 討論

CIK細胞過繼免疫治療腫瘤，克服了以往效應細胞增殖數量少，需輸注IL-2，低效及副作用大等的不足，現已成為腫瘤生物治療的重要分支，它對于促進患者免疫系統的重建、骨髓凈化、微小殘留病灶的清除以及防止腫瘤的復發和轉移等均具有重要的意義[4]。而作為免疫細胞體外增殖誘導的重要載體即為培養基，它直接關系著體外誘導結果，包括增殖數量、殺瘤效果等等，因為傳統培養基添加大量異體血清存在安全隱患，無血清培養基由于其所需血清大幅降低，在血源性細胞的培養中自身血樣中提取的小量血清即可滿足，甚至可以無需添加而被廣泛應用?，F在無血清培養基已用于血源性細胞的培養、真核系統中重組蛋白的表達、病毒及寄生蟲的繁殖等各個方面[5-9]。

無血清培養基MD-CM-STM-N和AIM-V是可用于臨床試驗的體外誘導免疫細胞的產品。本實驗中，筆者主要通過幾項重要指標測試其對體外增殖誘導免疫細胞的支持能力，是關于免疫治療的重要基礎條件。

CIK細胞是在多種細胞因子誘導條件存在下，從外周血、骨髓或臍血中分離出單個核細胞，經過一定時間培養而獲得的一種免疫活性細胞。其兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性與NK細胞的非主要組織相容性復合物（MHC）限制性殺瘤特點[10]，CD3、CD56能夠共同表達，因此此項免疫表型檢測也是探討依據。本文從細胞增殖能力、細胞免疫表型表達水平，對瘤細胞殺傷效果以及IFN-γ分泌能力等方面比較了無血清培養基對誘導免疫細胞的支持作用，為MD-CM-STM-N培養細胞因子誘導免疫細胞的臨床應用提供了依據。

從實驗結果中可以看出，MD-CM-STM-N和AIM-V培養細胞的增殖速度高于RPMI 1640培養基，并且增殖高峰期平臺得到延長，RPMI 1640組快速增長期在9～11d，而其余兩組在9～14d一直處于快速增殖水平，從最終增殖數目看MD-CM-STM-N更為理想，這說明AIM-V增殖能力較強并且穩定，而MD-CM-STM-N增殖能力最強也同樣穩定。

免疫表型的結果可以看出在CIK細胞重要表型指標、細胞毒性T細胞的表達，MD-CM-STM-N和AIM-V培養細胞也表現出明顯優勢，強度和持續時間均好于RPMI 1640對照組，MD-CM-STM-N在此項指標中結果顯示最優。由于前面提到CIK是兼具NK細胞特點的淋巴細胞，所以CD3+、CD56+的表達也是重要的指標，在此項檢測中MD-CMSTM-N和AIM-V培養細胞也表現出了優于RPMI 1640組的結果，但這一表型結果中AIM-V最好，可見MD-CM-STM-N更趨向T細胞的增殖優勢，而AIM-V則較多體現在NK細胞上的繁育特點。

目前CIK細胞的抗腫瘤作用機制還未完全明了，但普遍認為CIK細胞可被淋巴細胞功能相關抗原有關識別結構激活，導致胞漿毒性顆粒釋放和BLT酯酶產生而殺傷腫瘤細胞;因表面CD3受體結合而激活，導致胞漿毒性顆粒釋放而產生溶瘤作用;可產生大量炎性細胞因子，實現對腫瘤細胞的抑制或殺傷；CIK細胞也可誘導腫瘤細胞凋亡[11]。

本實驗所用兩種瘤細胞對殺瘤效果做了基礎探討，RPMI 1640殺傷效果不如另外兩組，而MDCM-STM-N和AIM-V在不同靶細胞的殺傷實驗中表現出差異，具體定向殺傷機制尚未完全明確。3種培養基培養細胞的IFN-γ分泌水平也有差異，這一指標可以代表細胞活化程度，MD-CM-STM-N和AIM-V組無明顯差異，但表現出優于RPMI 1640組的分泌穩定性，說明更利于維持細胞長時間活性。

由于無血清培養基增殖誘導活化功能，表現出更強更穩定水平，成分明確安全，對于臨床的追溯性更強，因此在免疫細胞治療中有著長遠優勢和應用前景，本文實驗結果顯示國內無血清培養基更適于生物治療研究。

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