重組人血管內皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用機制探討

杜國芳　王麗紅　裴毅

【摘要】 目的：觀察重組人血管內皮抑制素（Endostar，恩度）對小鼠肝癌H22的抗血管生成作用，并對其機制進行初步探討。方法：建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，隨機分為A、B、C、D組，每組8只。在不同時間分別對各組給藥。觀察實驗第18天小鼠腫瘤體積和微血管密度的情況。結果：實驗第18天，接種腫瘤當天開始腹腔給藥組（B組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度比較差異有統計學意義（P<0.05）。接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度比較差異無統計學意義。結論：單獨應用恩度（重組人血管內皮抑制素）有抗腫瘤作用，接種腫瘤時用藥為最佳給藥時機。

【關鍵詞】 肝癌； 治療； 恩度； 重組人血管內皮抑制素； 小鼠； H22肝癌細胞株

近代的理論研究發現腫瘤新生血管是腫瘤生長所必需的，實體腫瘤的生長和轉移與血管生成密切相關，腫瘤有兩種血管：即固有血管和因腫瘤細胞釋放VEGF（血管內皮生長因子）生成的新生血管，后者是腫瘤生長的決定條件。重組人血管內皮抑制素注射液（Endostar，YH-16恩度）是我國學者自主創新研發的新型人血管內皮抑素，其聯合化療治療NSCLC（非小細胞肺癌）有確切療效，但對其他惡性腫瘤治療的效果鮮有報道，從基礎研究資料看恩度的作用都指向抗血管生成，所以借助于鼠模型觀察恩度應用后腫瘤組織的生長情況，則能為下一步確定恩度的作用機制建立研究平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌H22瘤株，由中國藥品制品鑒定所引進。4～5周齡昆明小鼠，雄性32只，平均體重19～22 g/只，由山西中醫院研究所動物室提供。

動物室室溫22～24 ℃，相對濕度40%～45%，日光燈12 h人工照明，專用鼠糧自由進食，潔凈水自由飲用，動物實驗室為清潔級。

1.2 方法 將冷凍保存在-80 ℃冰箱中的H22肝癌細胞復蘇后，注射入昆明小鼠左腋下，7 d后，腫瘤生成明顯。在無菌條件下取腫瘤，以培養液調整其中瘤細胞密度至1×107個細胞/ml，用注射器吸取腫瘤懸液0.2 ml注入32只4～5周齡的雄性昆明小鼠右腋下的皮下進行接種，建立動物模型。將32只小鼠按隨機分組方法，分成A、B、C、D組，每組8只。A組開始給藥時間為實驗第1天。實驗第5天所有小鼠接種腫瘤。恩度3 mg/kg注入腹腔，1次/d，直至小鼠被處死或小鼠死亡。實驗第18天處死小鼠，留取腫瘤組織。A組于實驗第1天（接種腫瘤前）開始給藥。B組于實驗第5天（接種腫瘤日）開始給藥。C組于實驗第9天（接種腫瘤日后第4 d）開始給藥。D組對照組，只造模不給藥。眼眶取血后處死小鼠，解剖出腫瘤稱重。將全部標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片。免疫組化染色，抗CD34單克隆抗體標本。實驗藥物：恩度注射液（重組人內皮抑制素注射液）由山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產，批號20100303。實驗試劑：抗CD34單克隆抗體。

1.3 實驗數據收集 小鼠腫瘤指標測定：將接種后的昆明小鼠喂養在清潔級動物室內，每日使用電子天平測量各小鼠體重。從實驗第9天開始每日使用游標卡尺測量各小鼠右腋下腫瘤大?。▎挝粸閙m），計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×橫徑2/2。

1.4 染色結果判定及微血管密度的測定 CD34在光鏡下將血管內皮細胞標染為棕黃色。采用Weidner等提出的方法對研究結果進行MVD量化分析。首先在40倍光鏡視野下掃視整個切片尋找血管高密度集中的區域作為“熱點”，這些區域通常位于腫瘤邊緣區域的纖維組織中。然后在100倍光鏡視野下計數微血管數目，各計數5個高倍視野，取其平均值作為該標本的微血管數。凡單個孤立的或多個緊密排列的內皮細胞團，只要與鄰近腫瘤細胞及周圍結締組織成分分界清楚，不論有無血管腔，即可計數為1個微血管數。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0專用統計軟件進行數據統計分析。計量資料以（x±s）表示，用單因素方差分析對實驗數據結果進行方差齊性檢驗和統計分析，進一步采用LSD-t檢驗對數據進行多組間的兩兩比較分析與推斷。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗第18天，接種腫瘤當天開始給藥組（B組）與對照組（D組）腫瘤體積及微血管密度比較差異有統計學意義（P<0.05），接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積及微血管密度比較差異無統計學意義。見表1。

3 討論

恩度（重組人血管內皮抑制）是我國第1個上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物（恩度），在針對非小細胞肺癌（NSCLC）聯合化療的臨床試驗中顯示出良好的療效[1]。也有文獻報道，單獨用恩度治療僅3%有效，而此3%患者與其他腫瘤患者究竟是什么問題導致其治療效果的顯著差異，目前沒有解決。

在研究實驗中發現，如果抗腫瘤血管生成的治療方案確實有效，除了表現為腫瘤體積較小，生存時間延長外，在腫瘤的組織切片中也表現為血管密度明顯減少[2-3]。用CD34血管內皮細胞標記物檢測腫瘤新生血管的微血管密度（microvessel density，MVD），標記腫瘤微血管內皮細胞計算微血管密度（MVD）可以間接定量腫瘤血管發生情況[4]。因此本研究以此為研究方向，選用抗小鼠肝癌H22細胞株移植的腫瘤模型，在腫瘤接種的不同時間采用恩度治療，通過觀察腫瘤體積和腫瘤組織的血管密度，評價不同給藥時間恩度對腫瘤的作用，探索單用恩度療效差的原因，研究分4個組，其中觀察組3個，對照組1個，觀察組恩度用量一致，其中A組于接種腫瘤前4 d采用恩度治療，B組于接種腫瘤當日采用恩度治療，C組與接種腫瘤后4 d用恩度，三個觀察組中腫瘤體積和腫瘤組織血管密度與對照組比較，表1的研究結果表明：恩度治療后從腫瘤體積和血管密度觀察，恩度于腫瘤接種當天應用顯示出恩度的治療效果，與對照組相比二者均P<0.05，而恩度在腫瘤接種前和腫瘤接種后應用與對照組相比都不能使腫瘤血管密度和瘤體積發生變化（P>0.05）?；A研究認為：恩度作用于新生血管內皮的“爬行”，即腫瘤新生血管生成的“結果”階段，而腫瘤的生長需經兩個階段，即無血管期和血管產生后的快速增殖期[5]，因此本研究的結論可以認為恩度與接種同時進行，有可能抑制了血管內皮的爬行而遏制了腫瘤血管的快速增殖，而其他兩種情況就無此作用，顯然恩度對腫瘤的作用是有限的，這種限制與腫瘤接種生長有直接關系，而對預防性用藥和腫瘤已開始生長無關。

因此，恩度用藥時機有高度選擇性，作用于腫瘤生長的初期，其預防性用藥和腫瘤生長后用藥本研究未能看到確切的療效。本實驗研究恩度抗小鼠肝癌H22細胞株移植腫瘤的作用，選擇接種腫瘤前、接種腫瘤當天、接種腫瘤之后3個給藥時間。希望通過本實驗研究發現恩度抗腫瘤的最佳給藥時機。動態觀察恩度應用后腫瘤生長情況，反映恩度與血管生成的相關性。結果表明在實驗第18天，接種腫瘤當天開始給藥組（B組）與對照組（D組）相比腫瘤體積和微血管密度比較差異有統計學意義（P<0.05），而接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）與對照組（D組）腫瘤體積和微血管密度沒有統計學差異。說明腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，與之前的報道相符；用藥時機體現恩度抗腫瘤效果。本實驗提示接種腫瘤當日開始給藥能體現恩度抗腫瘤作用；而接種腫瘤前和腫瘤開始生長后給藥不能體現恩度抗腫瘤效果。由此可見，恩度有可能只作用于新生血管，提前給藥對腫瘤血管著床以及已形成的腫瘤血管生長均無效，腫瘤生長后給藥對已形成的腫瘤血管生長也無效。腫瘤接種以后，接種和生長幾乎同時，有可能接種以后刺激機體產生血管內皮生長因子，刺激腫瘤固有血管增生，恩度正是對此產生作用。接種腫瘤后開始給藥無效是符合理論的，接種腫瘤前開始給藥無效與理論不符，其機制有待進一步研究。為進一步研究恩度的抗腫瘤血管機制可對本實驗所留取腫瘤標本，比較不同時間、不同組別小鼠腫瘤體積和微血管密度之間的差別。

綜上所述，接種腫瘤當天開始腹腔注射恩度組（B組）小鼠腫瘤比單純造模組（D組）小鼠腫瘤小、腫瘤血管密度低，接種腫瘤前、后開始給藥組小鼠腫瘤體積與空白對照組小鼠腫瘤體積無統計學差異。接種腫瘤當天開始腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，具體機制有待進一步研究。希望隨著恩度抗腫瘤機制研究的進一步深入，恩度成為癌癥治療的必不可少的重要藥物之一。

參考文獻

[1] 王金萬，孫燕，劉永煜，等.重組人血管內皮抑素聯合NP方案治療晚期NSCLC隨機、雙盲、對照、多中心Ⅲ期臨床研究[J].中國肺癌雜志，2005，8（4）：283-290.

[2] Tan G H，Wei Y Q，Tian L，et al.Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen[J].Eur J Immunol，2004，34（7）：2012-2021.

[3] Tan G H，Tian L，Wei Y Q，et al.Combination of low-dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a accine induces synergistic antitumor activities[J].Int J Cancer，2004，112（4）：701-706.

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[5] 謝傳高，王興鵬.血管生成與胰腺癌[J].世界華人消化雜志，2001，9（3）：338-341.

（收稿日期：2012-09-05） （本文編輯：李靜）