副豬嗜血桿菌的診斷與防治

潘傳毅

（東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030）

副豬嗜血桿菌?。℉PS）是由副豬嗜血桿菌（Hps）引起的一種泛嗜性細菌性傳染病，1906年由德國學者Gllisser發現，故又稱“革拉瑟氏病”[1]。本病以纖維性多漿膜炎、腦膜炎和多關節炎為主要特征，并伴有發熱、咳嗽、呼吸困難、共濟失調和被毛粗亂等癥狀。Hps主要侵害仔豬尤其是早期斷奶仔豬，4～8周齡的豬對Hps也較敏感，本病的發病率一般為10%～20%，病死率有時可高達50%。本病呈世界性分布，據不完全統計，有38.9%～77.8%的豬攜帶潛在致病菌[2]。我國也從規?；B豬場中分離到了該病原菌。Hps感染已經成為早期斷奶仔豬和高度健康豬群的威脅，嚴重的影響了地區及世界經濟的發展，本文綜述了HPS的診斷與防治。

1 診斷

1.1 微生物學診斷

Hps是一種極難培養的細菌，通常很難從患病動物的純培養物中分離到該菌，尤其是發病豬經抗生素治療后，該菌的分離更為復雜。然而，細菌的分離非常重要，因為只有分離到細菌后才能作進一步的檢測。無菌采集胸腹腔積水、心包液、心血、關節液，分別接種于添加輔酶的副嗜血桿菌培養基平板，于37℃，5%CO2培養箱中培養24～48 h，結果均長出無色、透明、濕潤、光滑的露珠樣細小菌落。同時將該細菌進行革蘭氏染色，結果呈陰性、小球桿菌，老齡培養物呈多形態（細小桿狀、短鏈狀和長絲狀）。由于存在被其他易生長細菌干擾等因素，因此臨床檢驗中未分離到細菌并不代表Hps不存在。Hps在PBS（磷酸鹽緩沖液）中的存活時間分別為：42℃1 h、37℃2 h、25℃8 h，因此樣品采集后應立即培養或低溫運送到實驗室。

1.2 血清學診斷

血清學方法主要有瓊脂免疫擴散試驗（AGP）、補體結合試驗（CFT）、間接血凝試驗（IHA）以及酶聯免疫吸附試驗（ELISA），血清學方法具有反應靈敏、方便快捷的特點，適合于臨床大規模檢測。AGP是抗原、抗體在瓊脂凝膠中擴散，當二者在比例適當時相遇，即發生沉淀反應，形成肉眼可見的沉淀帶，目前最常用的是雙向單擴散和雙向雙擴散。IHA是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關的、一定大小的不溶性顆粒表面，然后與相應的抗體（或抗原）作用，在有電解質存在的適宜條件下發生特異性凝集反應。魏子貢等將Hps血清4、5型分離菌株經超聲波破碎處理后的產物致敏醛化紅細胞，建立了檢測Hps抗體的IHA，該法靈敏度高，但特異性差。ELISA是當前應用最廣、發展最快的一項新技術。將抗原（或抗體）吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色反應，底物顯色后用分光光度計或肉眼判定結果[3]。王艷等采用福爾馬林滅活的Hps全菌體作為包被抗原，建立了檢測Hps抗體的間接ELISA方法，確定Hps全菌體的包被濃度為2.24×107cfu·孔-1、檢測血清為1：200稀釋，同時確立了間接ELISA的最佳反應條件，結果表明，該方法有很高的特異性和重復性，14個發病豬場100份血清檢測結果Hps抗體陽性檢出率為94%[4]。Nedbalcova等用Hps超聲裂解抗原致敏紅血球，建立了Hps抗體間接血凝檢測方法，具有敏感性高、特異性強、重復性好等特點，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌的流行病學調查[5]。

1.3 分子生物學診斷

研究者根據細菌染色體上16srRNA基因的高度保守和具有種屬特異性的特點，建立了PCR診斷方法，該法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單和省時等特點。萬世平等根據Hps 16S rRNA基因設計了一對引物，通過最佳條件摸索擴增出大小為821 bp的特異目的基因片段，建立了快速檢測Hps的PCR方法，該方法最低檢出量達10-3ng，且對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌等均無交叉反應[6]。常規PCR只能進行定性，而不能定量DNA模板的拷貝數。隨著熒光定量PCR技術的快速發展，熒光定量PCR技術越來越多地應用于疾病的檢測。熒光實時定量PCR技術就是在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累計實時監測PCR反應過程，最后通過標準曲線對位置模板進行定量分析的方法。李軍等建立的實時熒光PCR方法最低檢測限是50拷貝·μL-1，重復性好，變異系數均＜2%，該方法特異性強，只能檢測Hps，不能檢測到豬鏈球菌2型、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌DH5A和豬傷寒沙門氏菌[7]。于江等采用煮沸法從Hps培養物中提取DNA，進行PCR擴增，將鑒定正確的目的基因片段克隆入pMD18-T載體中，轉化大腸桿菌DH5A，經PCR及測序鑒定后得到陽性重組質粒，作為陽性標準品，結果表明，該方法對Hps具有良好的特異性，不與其他豬源細菌發生交叉反應，其敏感性比常規PCR高100倍，而且非常穩定，批間與批內重復試驗變異系數均＜2.5%[8]。苗立中等提取Hps基因組，設計特異性引物，進行PCR擴增，回收目的片段，構建陽性標準模板，建立標準曲線，建立基于SYBR Green I的快速檢測Hps的實時熒光定量PCR方法，結果表明，線性關系在102～108copies·μL-1檢測范圍內良好；該方法敏感性比常規PCR高100倍，重復性試驗變異系數均小于205%，同時對Hps具有良好的特異性，建立的Hps SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法可用于臨床對Hps的快速診斷和定量檢測[9]。

1.4 其他

由于雜菌滋長而使Hps分離異常艱難，因此用免疫組化法（IHC）來診斷Hps感染時，即使Hps已被巨噬細胞殺滅而遺骸于胞漿中，也可輕易地被檢測到，但所使用的多克隆抗體與胸膜肺炎放線桿菌有交叉反應。曹蕓等利用原核表達并經過純化的Hps TbpB N端蛋白及人工合成的特異性多肽制備單克隆抗體，經碳化二亞胺（EDC）將純化后的單克隆抗體IgG與羧化乳膠共價偶聯，并對偶聯乳膠的IgG含量及偶聯時間等條件進行合理選擇，建立了快速檢測Hps的乳膠凝集試驗方法，結果表明，利用該方法檢測Hps疑似菌株，與16S rRNA-PCR方法的結果相比，符合率為83.1%，且致敏乳膠不與臨床常見菌株發生凝集反應，該方法具有操作簡便、快速、特異性高的特點[10]。宋鳳香等從山東某繁育豬場送檢的疑似病例中分離到4株革蘭氏陰性細小桿菌，通過培養特性試驗和生化試驗初步診斷為Hps，根據Hps 16S rRNA序列設計引物，進行PCR鑒定，結果表明4株分離菌株為Hps，對4株分離菌株進行小白鼠毒力試驗和藥敏試驗，結果表明，4株分離菌能致死小白鼠，對頭孢他啶、頭孢噻呋、氧氟沙星、多西環素、環丙沙星敏感，對土霉素、鏈霉素、林可霉素抵抗[11-13]。

2 防 治

2.1 飼養管理

應合理配制飼料，保證營養充足、平衡供給，特別是蛋白質和維生素及礦物質的供給。飼喂要做到定時、定量，提高飼料品質。降低飼養密度，加強豬舍通風對流，提高舍內空氣質量，冬季注意御寒保暖，夏季做好防暑降溫工作，減少斷奶、轉群、混群或運輸過程中應激對豬群的傷害。提高豬的抗病能力，減少該病的發生。

2.2 預防

疫苗的使用是預防Hps造成損失最為有效的方法之一，但是由于該病血清型多，免疫前要弄清該病在主場流行的血清型，選擇相對應血清型的疫苗免疫。有條件的豬場可以采集本豬場的病料做自家苗。種豬用副豬嗜血桿菌多價滅活苗免疫能有效防止仔豬早期發病，降低復發的可能性。免疫的同時最好結合科學的藥物治療，達到標本兼治的功效。初免母豬產前40 d一免，產前20 d二免。經免母豬產前30 d免疫1次即可。受本病嚴重威脅的豬場，仔豬也要進行免疫，根據豬場發病日齡推斷免疫時間，仔豬免疫一般安排在7～30日齡內進行，每次1 mL，最好一免后過15 d再重復免疫1次，二免距易發病日齡要間隔10 d以上。

2.3 治療

發病豬采用頭孢噻呋鈉5 mg·kg-1體重，2%黃芪多糖0.2 mg·kg-1體重，混合肌肉注射；20%氟苯尼考0.05 mg·kg-1體重，中藥制劑（金銀花、黃芩、連翹提取物）0.2 mg·kg-1體重，分別肌肉注射。豬群在日糧中加入阿莫西林400 g·t-1，5%普樂健1 kg·t-1，金霉素2 kg·t-1，連喂7 d，停3 d，再加喂3 d?；蛉芜x泰妙菌素50～100 mg·kg-1，氟甲砜霉素50～100 mg·kg-1，利高霉素44～1000 mg·kg-1，泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶各100 mg·kg-1，林可霉素200 mg·kg-1，環丙沙星 150 mg·kg-1等 1～2 種藥物拌料。當出現Hps感染時，將豬舍內所有病豬隔離，淘汰無飼養價值的僵豬或嚴重病豬；將豬舍沖洗干凈，嚴格消毒，改善豬舍通風條件，疏散豬群，減少密度，嚴禁混養。

3 小 結

近年來，Hps引起的危害日趨嚴重，對于該病的診斷通常依賴于豬群發病史、臨床癥狀、病理變化和細菌分離、檢測等做出診斷。與傳統診斷方法相比，近年來新引入的各種靈敏度高、專屬性強的實驗室檢測方法，使該病的診斷更加客觀和迅速。但是仍有許多問題尚未解決，例如許多分離株的血清型還不能分類定型，Hps感染的分子基礎也不十分清楚，在實踐中PCR和Southern blot方法的應用也存在困難，仍需要研究人員進一步的研究探討，從而尋找到一種更好的診斷治療方法。

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