大鼠胰島素瘤實驗模型的建立及其應用

彭亮，劉虹麟，成蘭云，房青，許世清，門秀麗，婁晉寧，張文健

大鼠胰島素瘤實驗模型的建立及其應用

彭亮，劉虹麟，成蘭云，房青，許世清，門秀麗，婁晉寧，張文健

目的通過移植大鼠胰島素瘤 INS-1 細胞至糖尿病小鼠腎包膜下使之形成胰島素瘤，并誘導其發生凋亡，建立可用于研究胰島 β 細胞凋亡機制的動物模型。

胰島素瘤； 模型，動物； 腎包膜下測定；胰島素分泌細胞； INS-1 細胞系

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2013, 8(3):178-183

胰島 β 細胞功能衰竭是 2 型糖尿病發展的一個重要環節[1]，胰島 β 細胞凋亡是導致其功能衰竭一個重要原因[2]。因此深入研究胰島 β 細胞凋亡的分子機制對闡明 2 型糖尿病的發生和發展以及對糖尿病的防治都具有重要意義[3-4]。

現已證明，高糖[5]、高脂[6]、細胞因子[7]、氧化應激[8]和內質網應激[9]等是誘導胰島 β 細胞凋亡的重要因素。由于正常胰島 β 細胞很難在體外長期培養，因此各種胰島素瘤細胞系如 INS-1[10]、RINm5F[11]、MIN6[12]和 NIT1[13]等已經成為研究胰島 β 細胞凋亡機制的細胞模型。雖然體外細胞模型可以研究各種刺激因素誘導的 β 細胞凋亡，分析相關的基因變化以及所涉及的分子機制，然而，由于動物機體的復雜性，體外細胞模型的研究結果并不能完全反應體內的病理過程。構建基因過表達小鼠或者基因敲除小鼠[14]雖然也可以評價某些基因在胰島 β 細胞凋亡中的機制，但由于轉基因動物制備的技術條件高、周期長以及動物代償機制的復雜性，這些模型的應用受到一定的限制。因此建立一種穩定、可靠和簡便的體內胰島素瘤模型對于研究胰島 β 細胞凋亡的分子機制和評價胰島細胞凋亡防治的藥物干預都具有重要的應用價值。

我們通過將大鼠胰島素瘤 INS-1 細胞移植至糖尿病小鼠左腎包膜下，制備了一種胰島素瘤動物模型，并應用這種胰島素瘤模型證實了內質網應激和高脂能夠誘導胰島 β 細胞凋亡，為研究胰島 β細胞凋亡的分子機制提供了簡單、穩定和可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 8 周齡雌性 BALB/c 裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001，飼養于中日友好醫院臨床醫學研究所 SPF 級動物房；大鼠胰島素瘤INS-1 細胞系由瑞士日內瓦大學王海燕博士惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 鏈脲霉素（streptozocin，STZ）、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、軟脂酸鈉（sodium palmitate，PA）以及胰蛋白酶購自于美國Sigma 公司；丙酮酸鈉以及無脂肪酸牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）購自美國Ameresco 公司；RPMI 1640 培養基、胎牛血清購自美國 Invitrogen 公司；細胞培養器材購自美國Costar 公司；TUNEL 凋亡檢測試劑盒、血糖儀及檢測試紙購于瑞士 Roche 公司；大鼠/小鼠胰島素ELISA 檢測試劑盒購于美國 Millipore 公司；手搖式離心機 No.1011 為德國 Hettich 公司產品；Multiskan Mks 酶標儀為美國 Thermo 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 INS-1 細胞接種于 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸鈉、50 μmol/L β 巰基乙醇的 RPMI 1640 培養基中，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養靜置，每隔 2 天換液傳代。

1.2.2 PA 以及 TG 的配置 PA 的配置：用0.01 mol/L NaOH 溶解 PA 至終濃度為 20 mmol/L，70 ℃ 水浴 30 min。將無脂肪酸的 BSA 用 PBS緩沖液配置成 5% 溶液，然后與 20 mmol/L PA 溶液按照 3∶1 的比例混合，配置成為 5 mmol/L PA貯液備用。TG 的配置：將 TG 溶于DMSO，配制成 20 mg/ml 的 TG 貯液備用。

1.2.3 利用 STZ 構建糖尿病小鼠 選用 8 周齡健康的 BALB/c 裸鼠，通過一次性、高劑量（180 mg/kg）腹腔給予 STZ 處理，不可逆地破壞其自身的胰島 β 細胞，給藥后每隔 3 天尾部取血監測空腹血糖變化，6 d 后血糖大于 20 mmol/L，成功構建糖尿病小鼠。

1.2.4 胰島素瘤動物模型的建立 首先將 INS-1細胞培養至對數生長期，經 0.025% 胰酶消化后離心并制備成細胞懸液。用一次性頭皮針連接 1 ml無菌注射器，再用此注射器將細胞懸液吸至頭皮針中，通過手搖式離心機離心，將頭皮針中的細胞聚集至針頭部位，以便于后邊的移植。然后將 STZ造模的糖尿病小鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉，按2 ml/kg 動物體重麻醉小鼠。小鼠取俯臥位，常規消毒后從左側腎臟部位平行脊椎切開一約 1 cm的切口，托出腎臟。將頭皮針針頭處的細胞團（約5 × 106個）移植入腎包膜下。還納腎臟于體內，分層縫合肌層及皮膚層。此后每隔 3 天檢測空腹血糖的變化，每隔 6 天檢測血清中胰島素水平的變化（由于檢測胰島素需要較多的血清，所以需要在每個時間點處死 3 只動物取血，檢測的是喂食后胰島素的水平，所以處死動物前先饑餓動物 12 h，然后喂食，30 min 后處死動物取血）。移植 INS-1細胞 18 d 后，手術摘取移植有 INS-1 細胞的左腎，將左腎用中性甲醛固定，石蠟包埋切片后進行HE 染色和胰島素的免疫組化染色。對于摘取左腎的動物繼續監測空腹血糖以及血清中的胰島素水平，9 d 后結束實驗。

實驗共分為 4 組：①對照組（不進行 INS-1細胞的移植）；② INS-1 移植組；③ INS-1 移植 +摘取左腎組；④未移植 + 摘取左腎組。

1.2.5 利用 PA 或 TG 誘導移植瘤發生凋亡 按照 1.2.4 的方法移植 INS-1 細胞至糖尿病小鼠的左腎包膜下，移植 18 d 后，開始腹腔給予凋亡誘導物 0.5 mg/(kg·d) TG 或 100 mg/(kg·d) PA，連續給藥 9 d，期間每隔 3 天檢測空腹血糖以及血清中胰島素水平的變化，最后取移植有 INS-1 細胞的左腎，固定包埋后切片，通過 TUNEL 原位染色法檢測 INS-1 細胞移植物的凋亡情況。

實驗共分 4 組：①對照組（不進行 INS-1 細胞的移植）；② INS-1 移植組；③ TG 誘導移植細胞凋亡組（進行 INS-1 細胞的移植，然后給予 TG處理）；④ PA 誘導移植細胞凋亡組（進行 INS-1 細胞的移植，然后給予 PA 處理）。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 利用 STZ 誘導 BALB/c 裸鼠發生糖尿病

圖 1 STZ 處理后動物空腹血糖的變化（**P < 0.01）Figure 1 Average blood glucose levels in fasted animals (**P < 0.01)

本研究希望將 INS-1 細胞移植給小鼠，建立其在動物體內的凋亡模型。由于建模過程中需要通過監測血糖的變化來間接反映移植的 INS-1 細胞在體內的存活情況，因此需要排除裸鼠自身胰島β 細胞的干擾。在本研究中我們采用一次性、大劑量 STZ 處理的方法，不可逆地破壞裸鼠自身的胰島 β 細胞。在給予 STZ 處理后，空腹血糖明顯升高（P < 0.01），在第 6 天裸鼠空腹血糖為（22.4 ± 2.3）mmol/L（圖 1），說明我們用 STZ 成功構建了糖尿病小鼠。

2.2 胰島素瘤動物模型的建立

圖 2 各組動物中空腹血糖（A）以及喂食后血清胰島素水平（B）的變化情況Figure 2 Average fasting blood glucose levels (A) and fed insulin levels (B) in animals of each groups

圖 3 INS-1 細胞移植 18 d 后相關指標的檢測（A：移植和未移植 INS-1 細胞的腎臟組織典型照片；B：HE 染色發現移植的 INS-1 細胞可以在腎包膜下形成腫瘤，標尺 = 200 μm； C：免疫組化染色發現 INS-1 細胞移植物中有胰島素的表達，標尺 = 200 μm）Figure 3 Examination of some related indexes after INS-1 cells xenograft (A: The mouse kidneys of each group at day 18; B: HE staining showed INS-1 cells can form tumors after subrenal capsules transplantation. Scale bar, 200 μm; C: Example case of insulin expression in INS-1 cells xenografts observed by immunohistochemical staining. Scale bar, 200 μm)

從移植后第 9 天開始，動物空腹血糖進行性降低（圖 2A），血清胰島素水平逐漸升高（圖 2B），而未移植組未見明顯變化，說明移植的 INS-1 細胞開始在腎包膜下存活，并開始釋放胰島素降低血糖。移植后第 18 天動物血糖接近至正常時，摘取動物左腎導致動物血糖顯著升高（圖 2A），血清胰島素水平降低（圖 2B）。在摘取的左腎可見明顯的移植瘤（圖 3A、B），免疫組織化學染色顯示移植瘤細胞為胰島素陽性（圖 3C），說明我們通過 INS-1細胞的腎包膜移植建立了胰島素瘤動物模型。

2.3 胰島 β 細胞體內凋亡模型的建立

利用已構建好的胰島素瘤動物模型，在 INS-1細胞移植 18 d 后開始腹腔給予 TG 或者 PA，發現TG 或 PA 會使動物的血糖進行性上升（圖 4A），血清中胰島素含量進行性降低（圖 4B）。我們推測，不同組別血糖和胰島素的差異可能是由于 TG 或者 PA 誘導了移植的 INS-1 細胞凋亡導致的。為了驗證我們的推測，在移植細胞后的第 27 天處死所有動物，取出移植有 INS-1 細胞的腎臟，固定包埋后進行 TUNEL 原位染色，發現 PA 或者 TG處理能夠顯著促進移植的 INS-1 細胞發生凋亡（圖 5），說明胰島 β 細胞凋亡的體內動物模型成功建立。

圖 4 各組動物中空腹血糖（A）以及喂食后血清胰島素水平（B）的變化情況Figure 4 Average fasting blood glucose levels (A) and fed insulin levels (B) in animals of each group

圖 5 TUNEL 染色法檢測 INS-1 細胞移植物的凋亡情況（**P < 0.01）Figure 5 The TUNEL staining was employed to detect the apoptosis in INS-1 cell xenografts (**P < 0.01)

3 討論

在 2 型糖尿病的發生和發展過程中，細胞凋亡導致的胰島 β 細胞功能衰竭是影響 2型糖尿病進程的關鍵環節[15]。因此研究和闡明胰島 β 細胞發生凋亡的分子機制對 2 型糖尿病的防治具有重要意義[4]。

在模型的構建中，我們選用了大鼠胰島素瘤INS-1 細胞。由于正常的胰島 β 細胞無法長期培養，所以人們常常用胰島素瘤細胞來代替胰島 β細胞在體外進行研究，INS-1 細胞就是較為常用的一種。由于它本身是瘤細胞[16]，有在體內形成腫瘤的能力，便于模型的構建。我們首先用 STZ 處理正常裸鼠，徹底破壞裸鼠自身的胰島 β 細胞，然后再進行 INS-1 細胞的腎包膜移植。這樣 INS-1細胞就成為動物體內唯一的分泌胰島素的細胞，在后繼誘導凋亡的過程中就可以通過監測動物血糖的變化，來間接反映移植的 INS-1 細胞的狀態。INS-1 細胞移植 18 d 后，動物的血糖明顯下降，而未移植組卻未見變化，使得我們推測移植的INS-1 開始存活，并且分泌胰島素來降低血糖。我們也通過 HE 染色證明了移植細胞在腎包膜下的存活，并通過免疫組化染色發現移植的細胞確實能夠分泌胰島素。接下來我們嘗試用凋亡誘導物來誘導移植的 INS-1 細胞發生凋亡。在糖尿病情況下，誘導胰島 β 細胞發生凋亡的因素有很多，包括高糖、高脂、內質網應激等。本研究選用了高脂誘導物 PA 和內質網誘導物 TG 來進行刺激。我們發現經過 PA 或 TG 的連續刺激，動物的血糖開始進行性升高，在第 9 天時發現 PA 或者 TG 能夠使得移植的 INS-1 細胞分泌的胰島素明顯下降，提示 PA 或 TG 有可能促進了移植細胞的凋亡，從而降低了胰島素的分泌。TUNEL 染色發現，PA以及 TG 確實引起了移植細胞的明顯凋亡，說明我們成功地構建了胰島 β 細胞凋亡的動物模型。

利用該模型可以將我們感興趣的基因在INS-1 細胞過表達或者敲降后移植給 STZ 造模的糖尿病小鼠，從而實現了基因在體內胰島 β 細胞過表達或者敲降，為胰島 β 細胞凋亡機制的研究提供簡單、經濟和易行的動物模型。

[1] Porte D Jr, Kahn SE. beta-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes: potential mechanisms. Diabetes, 2001, 50(Suppl 1):S160-S163.

[2] Butler AE, Janson J, Bonner-Weir S, et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes, 2003, 52(1):102-110.

[3] Thomas HE, McKenzie MD, Angstetra E, et al. Beta cell apoptosis in diabetes. Apoptosis, 2009, 14(12):1389-1404.

[4] Johnson JD, Luciani DS. Mechanisms of pancreatic beta-cell apoptosis in diabetes and its therapies. Adv Exp Med Biol, 2010, 654(19):447-462.

[5] Kim WH, Lee JW, Suh YH, et al. Exposure to chronic high glucose induces beta-cell apoptosis through decreased interaction of glucokinase with mitochondria: downregulation of glucokinase in pancreatic beta-cells. Diabetes, 2005, 54(9):2602-2611.

[6] Elsner M, Gehrmann W, Lenzen S. Peroxisome-generated hydrogen peroxide as important mediator of lipotoxicity in insulin-producing cells. Diabetes, 2011, 60(1):200-208.

[7] Kiaer C, Thams P. Serum albumin protects from cytokine-induced pancreatic beta cell death by a phosphoinositide 3-kinase-dependent mechanism. Endocrine, 2009, 35(3):325-332.

[8] Zhang Z, Liew CW, Handy DE, et al. High glucose inhibits glucose-6-phosphate dehydrogenase, leading to increased oxidative stress and beta-cell apoptosis. FASEB J, 2010, 24(5):1497-1505.

[9] Laybutt DR, Preston AM, Akerfeldt MC, et al. Endoplasmic reticulum stress contributes to beta cell apoptosis in type 2 diabetes. Diabetologia, 2007, 50(4):752-763.

[10] Park KG, Lee KM, Seo HY, et al. Glucotoxicity in the INS-1 rat insulinoma cell line is mediated by the orphan nuclear receptor small heterodimer partner. Diabetes, 2007, 56(2):431-437.

[11] Lortz S, Tiedge M, Nachtwey T, et al. Protection of insulin-producing RINm5F cells against cytokine-mediated toxicity through overexpression of antioxidant enzymes. Diabetes, 2000, 49(7):1123-1130.

[12] Chan JY, Biden TJ, Laybutt DR. Cross-talk between the unfolded protein response and nuclear factor-κB signalling pathways regulates cytokine-mediated beta cell death in MIN6 cells and isolated mouse islets. Diabetologia, 2012, 55(11):2999-3009.

[13] Hamaguchi K, Gaskins HR, Leiter EH. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes, 1991, 40(7):842-849.

[14] Chu KY, Li H, Wada K, et al. Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 is required for pancreatic beta cell survival and function in lipotoxic conditions. Diabetologia, 2012, 55(1):128-140.

[15] Prentki M, Nolan CJ. Islet beta cell failure in type 2 diabetes. J Clin Invest, 2006, 116(7):1802-1812.

[16] Janjic D, Asfari M. Effects of cytokines on rat insulinoma INS-1 cells. J Endocrinol, 1992, 132(1):67-76.

Establishment and application of rat insulinoma model in nude mice

PENG Liang, LIU Hong-lin, CHENG Lan-yun, FANG Qing, XU Shi-qing, MEN Xiu-li, LOU Jin-ning, ZHANG Wen-jian

ObjectiveTo establish an animal model to investigate pancreatic β cell apoptosis through transplanting insulinoma INS-1 cells into the renal capsules of streptozotocin (STZ) -treated diabetic mice.MethodsWe transplanted 5 × 106INS-1 cells into the left renal capsules of STZ-treated diabetic mice. After transplantation, the changes of fasted glycemia and fed insulin levels were monitored. When the glycemia reached to normal level, the left kidneys of the mice were removed. After that, the fasted glycemia and fed insulin levels were detected and the left kidneys were immediately fixed and subsequently examined by means of routine HE staining and insulin immuohistochemical staining to confirm establishment of insulinoma model. The insulinoma mice were i.p. injected once daily with palmitate (PA, 100 mg/kg per day) or thapsigargin (TG, 5 mg/kg per day) for 9 days, and the changes of fasted glycemia were monitored. When the glycemia was reversed, the left kidneys of the mice were removed, and TUNEL staining was employed to investigate β cell apoptosis in the xenografts.Results9 days after transplantation of INS-1 cells into the left renal capsules of STZ-treated diabetic mice, the fasting glycemia of the mice began to decline, and the fed insulin levels began to increase gradually. When the glycemia reached to normal level, removal of the left kidneys led to a significant increase in fasting glycemia. HE staining showed INS-1 cells can form tumors after subrenal capsules transplantation. Immunohistochemical staining showed insulin expression in the INS-1 cell xenografts. In insulinoma model, treatment of insulinoma mice with TG or PA led to increased fasting glycemia and decreased fed insulin levels. TUNEL staining showed that those treatments can cause significant cell apoptosis in xenografts.ConclusionInsulinoma animal model can be established by transplanting of rat insulinoma INS-1 cells into the renal capsules, and this model can be used to investigate the mechanism of the pancreatic β cell apoptosis in vivo.

Insulinoma; Models, animal; Subrenal capsule assay; Insulin-secreting cells; INS-1 cell lines

ZHANG Wen-jian, Email: zwj-72@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.03.004

國家自然科學基金（81200616）；國家高技術發展研究計劃（863計劃）（2011AA020107）；北京市自然科學基金（7122160）

100029 北京，中日友好醫院臨床醫學研究所

張文健，Email：zwj-72@163.com

2013-02-08

方法將 5 × 106INS-1 細胞接種于鏈脲霉素（STZ）造模的糖尿病小鼠左腎包膜下，監測動物空腹血糖和血清胰島素水平的變化，當血糖趨近正常后摘取動物左側腎臟并檢測其血糖和血清胰島素水平的變化；固定包埋摘取的腎臟，進行HE 染色以及胰島素的免疫組化染色，確定胰島素瘤模型的建立。在胰島素瘤動物模型中，腹腔給予毒胡蘿卜素（TG）或軟脂酸鈉（PA），監測給藥后動物空腹血糖的變化，當血糖濃度出現逆轉時，摘取動物左側腎臟，通過 TUNEL 原位染色法檢測移植瘤細胞的凋亡。

結果將 INS-1 細胞移植到糖尿病小鼠腎包膜下后，從第9 天開始，動物空腹血糖進行性降低，血清胰島素水平逐漸升高，當動物血糖接近至正常時，摘取動物左腎導致動物血糖顯著升高，在摘取的左腎可見明顯的移植瘤，免疫組織化學染色顯示移植瘤細胞為胰島素陽性。在胰島素瘤動物模型給予 TG 或 PA 刺激后，動物空腹血糖出現逆轉，顯著升高，血清中胰島素含量明顯降低，摘取動物左側腎臟后，TUNEL 原位染色發現移植瘤內有明顯的細胞凋亡。

結論大鼠胰島素瘤 INS-1 細胞腎包膜下移植可以建立胰島素瘤動物模型，應用此動物模型可以在體內研究胰島 β細胞凋亡的機制。

Author Affiliation:Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(3):178-183

關于進一步開展全國抗菌藥物臨床應用專項整治活動的通知

為進一步鞏固前兩年全國抗菌藥物臨床應用專項整治活動成果，促進抗菌藥物合理使用，有效控制細菌耐藥，保證醫療質量和醫療安全，按照 2013 年全國衛生工作會議精神、2013 年衛生工作要點和三年活動工作安排，國家衛生和計劃生育委員會組織制定了《2013 年抗菌藥物臨床應用專項整治活動方案》。詳情請登錄 http://www.moh.gov.cn/mohyzs/s3585/201305/ 6042979f05cf49609e96410d7314ecae.shtml 查閱。