虎眼萬年青EST文庫構建和Syntaxin基因的克隆及生物信息學分析

陳 茜，王志標，唐 微，王 偉，程克棣，孔建強

虎眼萬年青EST文庫構建和Syntaxin基因的克隆及生物信息學分析

陳 茜，王志標，唐 微，王 偉，程克棣，孔建強

目的 構建虎眼萬年青 EST 文庫，篩選相關基因并對其進行功能鑒定。

基因文庫； Qa-SNARE 蛋白質類； 虎眼萬年青

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2013, 8(4):247-253

虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae）是原產于南非的觀賞植物，1992 年從中發現了具有顯著抗癌活性的甾體類皂苷化合物 OSW-1[1]，它對多種惡性腫瘤細胞都有非常強的抑制作用，是迄今所發現的抗癌活性極強的化合物之一，其 IC50值在0.1 ～ 0.7 nmol/L 之間，高出臨床應用的抗癌藥物[阿霉素（adriamycin）、順鉑（cisplatin）、喜樹堿、絲裂霉素 C 和紫杉醇等] 10 ～ 100 倍，更重要的是它對正常細胞幾乎沒有抑制作用，具備非常良好的藥用前景[1-2]。然而，由于 OSW-1 在虎眼萬年青中含量極低，限制了它的進一步應用。因此，尋找一種切實可行的替代方法來提高虎眼萬年青皂苷產量對于加快其成藥性研究具有非常重要的意義。合成生物學（synthetic biology）的迅猛發展給OSW-1 的規?；苽涮峁┝艘粋€很好的契機[3-5]。

合成生物學的物質基礎是核酸，克隆天然產物生物合成相關功能酶基因以及重要的調控基因并對其進行功能鑒定是進行天然產物合成生物學研究的關鍵一步?；诖?，本論文通過 SMART（switching mechanism at 5'end of mRNA template）法構建了虎眼萬年青的全長 cDNA 文庫，并利用該文庫篩選到了細胞囊泡轉運和物質分泌重要調控蛋白之一的 Syntaxin 的編碼基因，對其進行了序列分析和初步的表達研究，從而為進一步的功能鑒定奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 植物材料 虎眼萬年青鱗莖自澳大利亞引進，經過誘導后形成愈傷，然后重新誘導出鱗莖。取出無菌鱗莖，放入液氮中速凍，于 -70 ℃ 保存備用。

1.1.2 菌種和試劑 RNeasy plant mini kit 購自德國 Qiagen 公司；大腸桿菌 Trans1-T1、Transetta (DE3) 以及 T-A 克隆時所用試劑盒 pEASYTMBlunt zero cloning kit 購自北京 Transgen 公司；表達載體 pET-28a(+) 購自德國 Novagen 公司；KOD-Plus 聚合酶購自日本 Toyobo 公司；鼠源His-Tag 單克隆抗體、酶標二抗（山羊抗小鼠 IgG）；IPTG 和卡那霉素購自北京紐樸生物技術有限公司；快速連接試劑盒 In-FusionTMadvantage PCR cloning kit w/cloning enhancer 試劑盒購自美國Clontech 公司；蛋白 marker 購自立陶宛 Fermentas公司。

大腸桿菌在不加抗生素的 LB 培養基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl）中進行培養，轉化菌株的選擇和誘導在加有 50 μg/ml卡那霉素的 LB 中進行。

1.1.3 主要儀器 Mastercycle/5333000.018 高精度梯度 PCR 儀購自德國 Eppendorf 公司；Biospectrum 凝膠成像儀購自美國 UVP 公司；Model 3000Xi 瓊脂糖凝膠電泳儀和 PowerPac 電泳儀均購自美國 Bio-Rad 公司；VCX130 超聲波破碎儀購自美國 Sonics 公司。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取和 cDNA 文庫的構建 取50 ～ 100 mg 的虎眼萬年青鱗莖，液氮研磨成粉，采用 CTAB 法提取總 RNA。通過紫外分析儀檢測所提 RNA 的濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。采用 Oligote x mRNA mini kit 純化總 RNA。使用 SMARTTMPCR cDNA synthesis kit合成 cDNA 一鏈和二鏈。使用 QIAquick PCR purification kit 純化擴增得到的雙鏈 cDNA，進行全長 cDNA 的均一化。均一化的 cDNA 經 Sfi 酶切后，電泳檢測，將酶切產物的 1 ～ 3 kb 區域切下，并將產物回收后與 pDNR-LIB 載體連接，將連接產物加到 0.25 μm Millipore 純化膜上脫鹽純化 1 h，電擊轉化到大腸桿菌 DH10B 中，菌液涂于氯霉素平板上。隨機挑取克隆進行菌落 PCR 鑒定，電泳檢測插入片段大小及小片段比率。

1.2.2 EST 測序及分析 在 ABI 3730XL 全自動 DNA 測序儀上，隨機對文庫中的 1440 個cDNA 克隆進行 5′ 末端測序分析，測序通用引物分別為 T7，EST 測序和生物信息學分析由北京華大基因完成。用 phrap 軟件對 Clean EST 序列進行組裝和拼接，得到所測 EST 的相應 Unigene 數據。用 BLASTP（BLASTX）將 Unigene 數據與COG（clusters of orthologous groups of proteins）數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）進行比對分析（期望值標準為 1e ～ 10），獲得虎眼萬年青表達基因的功能注釋及其 COG 功能分類。

1.2.3 Syntaxin 基因的克隆 從測序的 EST 序列中發現兩段基因分別與 Syntaxin 43 基因具有同源性，而且推斷可能分別是同一個 Syntaxin 基因的5' 端和 3' 端。因此，設計引物 F10343-1/R10343-1和 F10343-2/R10343-2（表 1），以虎眼萬年青 cDNA為模板，通過巢式 PCR 的方法克隆得到一條長約為 1300 bp 的條帶，將其通過平末端連接的方式克隆到載體 pEASYTM-Blunt Zero 中，獲得重組質粒pEASY-syntaxin 43，送樣測序。

1.2.4 Syntaxin 蛋白的生物信息學分析 利用NCBI 的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/orfig.cgi）軟件對擴增得到的 cDNA 序列進行ORF 分析；利用 Protein Blast（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PRO GRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW _DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）進行Syntaxin 氨基酸的同源性分析；利用 Pfam（http:// pfam.janelia.org/search）程序對克隆得到的基因編碼蛋白進行蛋白家族預測；用 Expasy 中的工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預測Syntaxin 蛋白的理化性質；通過 TMpred（http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預測 Syntaxin 蛋白的跨膜區；利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對 Syntaxin蛋白進行信號肽預測；采用 TargetP 1.1（http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析預測 Syntaxin 的細胞定位。

表1 本實驗中用到的引物Table1 Primers used in this experiment

1.2.5 Syntaxin 基因的表達和免疫印跡

1.2.5.1 含 Syntaxin 基因的大腸桿菌表達載體的構建 以 Fet28a10343/Ret28a10343 為引物，pEASY-syntaxin 43 為模板，擴增得到的序列與用EcoR I/Hind III 酶切的 pET-28a(+) 進行 In-Fusion連接，連接產物轉化 E.coli Trans1-T1，37 ℃ 培養，挑取陽性克隆進行測序。測序正確的載體命名為pET28a10343，用于原核表達。其中涉及到的分子生物學技術參考文獻[6]，In-Fusion 連接的相關操作參考 Clontech 公司的說明書。

1.2.5.2 Syntaxin 基因在 E.coli 中的表達及鑒定 采用 CaCl2法將 pET28a10343 轉化到 E.coli Transetta(DE3) 中，篩選正確后，挑取陽性克隆接種到 10 ml 加有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 培養基中，37 ℃ 振蕩培養到 OD600= 0.6 左右，取 1 ml菌液，13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀用無菌 ddH2O 涮洗 2 遍，然后轉接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培養基中，37 ℃ 培養至 OD600= 0.6。13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀用無菌ddH2O 涮洗 3 遍，然后將沉淀轉接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培養基中，加入 0.1 mmol/L IPTG，在 16 ℃ 誘導 16 h，取 1.5 ml 菌體，加入裂解液A（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1 mmol/L DTT）300 μl，超聲破碎，13 000 × g 離心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 電泳。

包涵體形式存在的蛋白提取，需在以上步驟，即13 000 × g 離心 18 min 后，棄上清，加入 6 mol/L尿素 50 μl，于 -20 ℃ 沉淀 1 h 后 13 000 × g 離心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 電泳。

1.2.5.3 E.coli 重組 Syntaxin 的蛋白印跡分析 所用一抗為抗 His-Tag 的小鼠單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠 IgG（1∶2000），以帶有 His 標簽的重組質粒 pET28a10343 組為實驗組，以pET-28a(+) 空載體組為對照，用 eECL Western blot kid 化學發光試劑盒檢測 Syntaxin 的蛋白表達。

圖1 菌落 PCR 電泳結果Figure1 The results of clony PCR

圖2 Syntaxin 基因電泳結果Figure2 PCR amplification of Syntaxin gene

2 結果

2.1 虎眼萬年青全長 cDNA 文庫的構建

文庫構建好后，取 1 μl 菌液涂平板（直徑15 cm），計算平板上的庫容數，約為 750個，通過計算可以得出菌液滴度為 7.5 × 105cfu/ml。轉化菌1.4 ml，所以庫容為 1 × 106，以整個連接計算，庫容大于 3 × 106。從文庫中隨機挑取 24 個克隆進行菌落 PCR 鑒定，電泳結果見圖 1。結果顯示，插入片段平均大于 1.5 kb， 且分布在 1 ～ 3 kb 之間。

2.2 EST 分析

對隨機挑取的 1440 個 cDNA 克隆進行測序，獲得 1398 個有效序列，其中含有 1292 個高質量 EST 序列。利用 Phrap 軟件進行 EST 序列組裝，得到單一基因序列（unigene）為 1146 條，其中包括 98 個重疊群（contig），1048 個單一 EST序列（singlet）。分析表明，EST 文庫的全長率 54%，冗余率 3.3%。進一步的比對分析表明，1146 條虎眼萬年青單一基因序列在 COG 數據庫中只有266 個序列可獲得生物學功能注釋，因此，如果只采用 COG 一種數據庫進行分析，虎眼萬年青鱗莖表達基因的鑒定率僅為 23% 左右。

2.3 Syntaxin 基因的克隆及生物信息學分析

通過巢式 PCR，從虎眼萬年青中分離得到一條長為 1265 bp 的條帶（圖 2），通過生物信息學分析表明，擴增得到的 Syntaxin 基因的 ORF 區共810 bp，編碼 269 個氨基酸，5' 非翻譯區為 145 bp，3' 非翻譯區為 310 bp。將該序列遞交給 GenBank，獲得注冊號是 KF241989。通過 Protein Blast 分析表明，該基因編碼蛋白和植物的 Syntaxin 同源性較高，而且在植物中比較保守（83.58% 的同源性）（圖 3）。

利用 Pfam（http://pfam.janelia.org/search）程序對克隆得到的基因編碼蛋白進行蛋白家族預測，結果表明，該基因最有可能編碼一個 Syntaxin 蛋白（E-value = 6.7E-13），編碼序列中含有一個 SNAREdomain（179 ～ 241 aa）。

通過 ProtParam 對該蛋白進行理化性質分析，結果表明該蛋白分子式為 C1300H2113N381O423S11，分子量是 30.2 kD，pI = 5.17，該蛋白不穩定，是個親水蛋白（GRAVY = -0.567），提示其可能是膜結合蛋白。

通過 TMpred 分析，揭示 Syntaxin 有 1 個跨膜區域（246 ～ 264 aa），而且 Score值很高，說明Syntaxin 很有可能是一個跨膜蛋白。蛋白質序列含有跨膜區提示它可能作為膜受體起作用，也可能是定位于膜的錨定蛋白或者離子通道蛋白等。含有跨膜區的蛋白質往往和細胞的功能狀態密切相關，從Syntaxin 的功能來分析，作為膜的錨定蛋白的可能性較大。

利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）對 Syntaxin 蛋白進行信號肽預測，結果表明，該蛋白沒有信號肽，不是一種分泌蛋白，推測該蛋白極有可能是一種膜結合蛋白，這和TMpred 分析是一致的。采用 TargetP 1.1（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析預測 Syntaxin的細胞定位，結果表明，該蛋白定位于線粒體或分泌途徑的可能性很少（得分分別為 0.074 和0.070），可能定位在其他的細胞位置，如膜上（得分為 0.936）。

2.4 含 Syntaxin 基因的表達載體的構建

采用快速連接 In-Fusion 技術將 Syntaxin 基因插入大腸桿菌表達載體 pET-28a(+) 的多克隆位點 EcoR I/Hind III 之間，得到的重組克隆送樣測序。結果表明，載體構建正確，命名為 pET28a10343，含有完整的 Syntaxin 基因。將 pET28a10343 轉入大腸桿菌 Transetta(DE3) 中，篩選得到陽性克隆E.coli[pET28a10343]。

2.5 重組 Syntaxin 的 SDS-PAGE 分析

E.coli[pET28a10343]在 16 ℃ 誘導 16 h 后，取 1 ml 菌液，13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀超聲破碎后，分別對上清和包涵體進行 12% 的SDS-PAGE 分析（圖 4），結果顯示，經過誘導的E.coli[pET28a10343]重組菌上清中誘導條帶不明顯，而包涵體中出現了一條大小為 35 kD 的條帶，而對照未經誘導的 E.coli[pET28a10343]沒有出現條帶，初步表明 Syntaxin 基因在 E.coli 中成功表達，而且是以包涵體形式存在。

2.6 重組 Syntaxin 蛋白的免疫印跡分析

為確證 Syntaxin 基因得到表達，進行了免疫印跡分析。離心收集 E.coli[pET28a10343]的菌體，用超聲破碎液進行 SDS-PAGE 電泳，采用 Western blot 進行檢測（圖 5）。結果表明，與對照相比，E.coli[pET28a10343]經免疫印跡后，在相應的位置上出現了一條相應的雜交帶。因此，確認重組的Syntaxin 蛋白具有特異的免疫活性，表明 Syntaxin基因在 E.coli 中得到了表達。

圖4 重組 Syntaxin 的 SDS-PAGE 結果Figure4 Expression of recombinant Syntaxin protein

圖5 E.coli 重組 Syntaxin 蛋白的 Western blot 結果Figure5 Western blot analysis of rexombinant Syntaxin protein

3 討論

Syntaxin 是 SNARE（soluble N-ethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptor）復合物中最重要的組成成分[7-8]，參與調控細胞囊泡轉運和物質分泌過程，在介質質膜的導向、錨定、融合和胞吐作用中起著核心作用，是參與調節神經內分泌-免疫炎性細胞釋放神經遞質或炎性介質不可少的結構和功能單位。和動物中的 Syntaxin 的研究相比，植物中 Syntaxin 的研究相對較少?，F在已知 Syntaxin 在植物中成員眾多[9]，參與了多種生理作用。Syntaxin 蛋白通過和 SNARE 蛋白相互作用，參與植物細胞膜結構的融合[10-11]，此外，Syntaxin 還參與了植物抗病[12-13]等生理過程，因此開展針對植物 Syntaxin 基因的研究具有很重要的意義。

在本項目中，全長 Syntaxin 基因的克隆方法對今后利用該文庫篩選其他基因具有借鑒意義。在本論文中，我們從 EST 文庫中分別得到了兩條和Syntaxin 具有同源性的片段，如何判斷這兩條片段是否屬于同一基因，對于能否快速獲得全長該基因很重要。如果推斷這兩條片段不屬于同一個基因，則需要通過 RACE 將 Syntaxin 基因缺失的部分擴增出來，需要花費一定的時間。而如果能有效地判斷這兩個片段屬于同一個基因，則只需根據這兩個片段序列，設計特異的引物，通過常規巢式 PCR就能快速地克隆得到我們需要的全長 cDNA，由此看來，通過生物信息學對兩個片段是否屬于同一個基因是快速克隆該全長基因的前提。在本實驗中，我們首先通過 Blast Protein 對這兩個序列分別進行同源序列查找，結果發現，這兩個序列和同一個已知氨基酸序列的同源性近似相等，而且，GC 含量分析表明，這兩個片段的 GC 含量比較相似，根據這兩點，初步判斷這兩個序列分別屬于同一個Syntaxin 基因的 5' 和 3' 端。我們據此設計了特異的引物，通過常規 RT-PCR，快速地克隆得到了該Syntaxin 基因。

在本實驗中，Syntaxin 的理論分子量是 30 kD，而通過 SDS-PAGE 分析表明 Syntaxin 的分子量是 35 kD，之所以造成 Syntaxin 重組蛋白大小出現差異的原因前人早有分析[14]，推測可能是pET-28(+) 上的 His- 標簽對重組蛋白產生影響，導致分子量和理論值出現差異。

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Construction and characterization of normalized full-length cDNA library and gene cloning of Syntaxin from Ornithogalum saundersiae

CHEN Xi, WANG Zhi-biao, TANG Wei, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang

Objective Construction of Ornithogalum saundersiae EST library to facilitate the gene screening and functional characterization. Methods The total RNA of Ornithogalum saundersiae was isolated by CTAB method. A normalized full-length cDNA library, with titer of above 3 × 106cfu/ml, was established by the method of SMART using the total RNA of young bulb of Ornithogalumsaundersiae as the template. Sequencing analysis of 1440 clones, which were selected randomly from the constructed EST library of Ornithogalum saundersiae was performed. Blast analysis (NR, NT, Swiss-Prot and KEGG) and COG function classification were done using the acquired EST sequences.Results The average size of cDNA inserts was 1500 bp with a redundancy rate of 3.3%. Meanwhile a total of 1146 unigenes were attained by sequencing. These results indicated that the normalized full-length cDNA library was established successfully. Two cDNA sequences, similar to Syntaxin gene, were screened from cDNA library. Blast analysis showed the two sequences were probably the 5' and 3' sequence of the same Syntaxin gene. Two pairs of primers based on the specific Syntaxin gene were synthesized. The full-length Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saundersiae by standard RT-PCR. The Syntaxin gene was cloned into the E.coli expression vector pET-28a(+) and the recombinant E.coli containing Syntaxin gene was induced to express by IPTG addition. SDS-PAGE and Western blot results indicated that the Syntaxin gene was successfully expressed in E.coli.Conclusion The Ornithogalum saundersiae EST library was successfully constructed. A full long cDNA similar to Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saumdersiae and then heterologous expression in E.coli was performed successfully, which laid the foundation for further functional characterization of Syntaxin gene in the future.

Gene library; Qa-SNARE proteins; Ornithogalum saundersiae

KONG Jian-qiang, Email: jianqiangk@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.002

天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室優秀青年人才基金（B-2011-4）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/衛生部天然藥物生物合成重點實驗室（陳茜、王志標、王偉、程克棣、孔建強）；430071 武漢大學基礎醫學院（陳茜、唐微）

孔建強，Email：jianqiangk@imm.ac.cn

2013-03-15

方法 CTAB 法提取虎眼萬年青鱗莖總 RNA，通過SMART 方法構建全長 cDNA 文庫，獲得庫容大于 3 × 106cfu/ml 的均一化全長 cDNA 文庫。隨機挑取 1440 個單克隆測序，并對得到的 EST 序列進行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分類。

結果 獲得 1398 條有效 EST 序列，含有 1146 條單一基因，cDNA 文庫平均插入片段長度在 1.5 kb 以上，全長率54%，冗余率 3.3%。其中兩段基因都與 Syntaxin 43 基因相似，同源性分別為 76% 和 89%，根據 Blast 比對結果，推斷這兩個基因片段是同一個 Syntaxin 基因的 5' 端和 3' 端。據此設計引物，以虎眼萬年青 cDNA 為模板，通過常規的 RT-PCR 擴增得到全長 Syntaxin 基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體，接著導入大腸桿菌進行誘導表達，SDS-PAGE 和 Western blot 證實該基因在大腸桿菌獲得表達。

結論 首次構建成功虎眼萬年青 EST 文庫；并從中篩選得到一條和 Syntaxin 具有同源性的基因，實現了 Syntaxin 蛋白在大腸桿菌中的表達，為 Syntaxin 基因功能的鑒定奠定基礎。

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (CHEN Xi, WANG Zhi-biao, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang); School of Medicine of Wuhan University, Wuhan 430071, China (CHEN Xi, TANG Wei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):247-253