100μL移液器國際比對不確定度的分析與評定*

佟 林 王金濤 劉子勇 郭立功 暴雪松 趙曉惠

(中國計量科學研究院，北京 100013)

0 引言

移液器是具有一定量程范圍，可將液體從容器內吸出，移入另一容器內的計量器具，作為量出式量器，分為定量和可調兩種，廣泛用于醫院、輸血站、生化實驗室、環境實驗室、制藥實驗室、食品等分析實驗室的精密微量取樣，可以對少量液體樣品及試液進行迅速、準確的定量取樣和加樣。

隨著醫療衛生、生物、制藥、能源等領域的發展，微量移液器作為近幾年的新產品，其加樣更為精確，有利于提高實驗的準確性與重復性，解決了大量分析試驗中快速、準確微量取樣的難題，替代了過去的玻璃吸管，在上述領域取得了廣泛應用。據Global Industry Analysts發布的最新數據，亞太地區微量移液裝置的增長率為5.7%，預計到2012年全球微量移液裝置的市場將達到9.962億美元，同時全球對移液器的保有量也在快速增長，這就要求世界各國對微量移液器的檢定及校準能力要與國際接軌。

1 比對情況介紹

國際計量局(BIPM)流量計量工作組(WGFF)第10次年會于2010年10月在臺灣舉行。會議上，與會代表一致同意進行一次微小量的國際間比對。本次關鍵比對的目的在于，通過比對來檢驗各參比實驗室對100μL移液器進行校準以及校準結果的一致性，及不同的測量設備和校準方法所帶來的不確定度。

葡萄牙質量學會(IPQ)下屬的容量實驗室作為主導實驗室，負責比對方案的確定、傳遞標準的選取、以及后續的數據分析等工作。中國計量科學研究院(NIM)以及墨西哥國家計量中心(CENAM)被選為副主導實驗室，協助主導實驗室進行比對安排，以及比對數據的整理及傳遞標準值的確定等相關工作。

參加本次國際關鍵比對的國家有：葡萄牙、南非、中國、墨西哥、巴西、英國、土耳其、法國、肯尼亞，比對過程中英國計量院退出，各參比實驗室均采用靜力稱重法對移液器進行校準，比對采用環式路線進行，本次比對于2011年7月開始，并于2012年7月結束。

本次比對選用的傳遞標準是單頭型定量移液器，如圖1所示，共配備5支，編號分別為：354828Z、354853Z、354864Z、354868Z、354872Z。

圖1 傳遞標準

2 用于微量容積值計算的數學模型

微量移液器是一種量出式計量器具，其校準方法主要有靜力稱重法、光度吸收法和滴定法等方法，其中一般以靜力稱重法的準確度最高。由于此次國際比對的量值為100μL，在這個量程靜力稱重法的優勢比較明顯，所以本次國際比對采用靜力稱重法進行微量液體容積值的測量,并換算成標準溫度20℃下容積值，其數學模型為：

×[1-γ(t-20)]

(1)

式中：V20為修正到20℃下的容積值，μL；II為帶液過渡容器質量值，mg；IE為過渡容器空稱質量值，mg；ρW為實驗溫度下的水密度值，通過Tanaka公式計算[2]，mg/μL；ρA為空氣密度，mg/μL；ρB為砝碼密度，mg/μL；γ為移液器的熱膨脹系數,2.4×10-4℃-1；t為實驗過程中水溫度，℃。

由于微量移液器作為活塞式量器，是通過活塞的移動產生負壓和正壓進行吸液及放液。即使活塞容積不發生變化，活塞內大氣壓強的變化也會導致在相同溫度條件下移液器吸液量和排液量的不一致。這是由于微量移液器內部與外部氣壓不同從而產生壓強差，而壓強差又導致殘留量和移液器虹吸現象的出現。通過修正后可以計算出液體的變化量。修正后的微量容積值計算模型為：

(2)

式中：Vt為活塞室容積，μL；g為重力加速度，m/s2；hw為吸液嘴中升高的液柱，m；pL,X1為X1中大氣壓強，Pa；pL,X2為X2中大氣壓強，Pa；ρw為X2中水密度，kg/m3。

3 不確定度評定

在測量過程中有許多影響因素成為了不確定度源，例如人為操作因素、儀器本身的不確定度、水的密度以及空氣密度和大氣壓力等等，現以354828Z移液器為例，進行不確定度的分析。

3.1 標準不確定度的A類評定

按比對技術要求，對354828Z移液器，在同一條件下進行了10次獨立的重復測量，得出其在標準溫度20℃下的容積值，詳見表1。

表1354828Z測量結果統計表

由貝塞爾公式求得測量值的實驗標準差：

由測量重復性導致的測量結果的A類標準不確定度為：

3.2 標準不確定度的B類評定

3.2.1 水質量測量引入的不確定度分量u(M)

移液器排出的水質量是通過電子天平稱量獲得的，因此水質量測量B類不確定度取決于天平和砝碼的測量誤差，其中天平測量不確定度影響因素為靈敏度、分辨率和偏載，分別為us、ud和uE，砝碼測量不確定度為uW，計算公式如下所示：

式中：us為電子天平的靈敏度,mg；ud為電子天平的分辨力,mg；uE為電子天平的偏載,mg。

=5.77×10-3mg

3.2.2 砝碼密度引入的不確定度分量u(ρB)

砝碼密度的測量誤差為0.14g/cm3，(k=2)，所以：

u(ρB)=0.14/2=7.0×10-2g/cm3

3.2.3 空氣密度引入的不確定度分量u(ρA)

按照CIPM推薦使用的空氣密度計算公式，分析計算可以得到空氣密度的測量的標準不確定度為：

u(ρA)=6.7×10-7g/cm3

3.2.4 水密度引入的不確定度分量u(ρW)

測量介質為去離子水，所以水密度采用了國際實用溫標水密度值，其允差為±1×10-4g/cm3，服從均勻分布條件，其測量標準不確定度為：

3.2.5 移液器體脹系數引入的不確定度分量u(β)

移液器的熱膨脹系數為2.4×10-4℃-1，根據經驗值取u(β)=1.0×10-6℃-1。

3.2.6 水溫度測量引入的不確定度分量u(t)

水溫度測量誤差為±0.01℃，考慮到水溫梯度的影響，服從均勻分布條件，其測量標準不確定度為：

3.2.7 稱量過程中水蒸發量引入的不確定度分量

移液器校準過程中，所排放水在稱量時蒸發量按經驗值取1.15×10-2μL。

通過對式(1)進行偏微分求導之后，得到B類不確定度分量：

=1.42×10-2μL

3.3 合成標準不確定度

上述不確定度評定方法僅僅適用于傳遞標準非常穩定的條件下，即傳遞標準本身的不確定度可以忽略。但是在測量中發現移液器(特別是微量移液器)受結構的影響性能不是足夠的穩定，所以需要將傳遞標準不穩定性所引入的不確定度分量考慮在內。比對過程中，主導實驗室在不同時間對作為傳遞標準的移液器進行了3次測量，以此來檢驗其在傳遞過程中的穩定性，同時也對移液器校準過程中操作方法[7](如移液器吸液嘴侵沒深度、侵沒角度、放液速度、放液角度等)進行了實驗性研究，通過研究發現移液器自身結構所造成的最大允許誤差能夠達到±0.4%(Eexp)，因此需按式(3)計算新增的不確定度分量：

(3)

式中：s為主導實驗室標準不確定度；n為主導實驗室對同一支移液器校準次數，取n=3；Eexp為移液器最大允許誤差，按經驗值取Eexp=0.4%。

通過式(3)計算得出ust為0.13μL

所以，經過修正之后的合成標準不確定度計算方法為：

354828Z號移液器測量結果的不確定度分量匯總表如表2。

3.4 擴展不確定度

取k=2，則擴展不確定度：

4 比對結果分析

本次比對選用各參比實驗室測量結果的加權平均值作為參考值，按式(4)計算。

(4)

此時加權算術平均值的標準不確定度按式(5)計算。

表2不確定度分量匯總表

(5)

通過計算得出參考值Y=100.03μL，加權算術平均值的標準不確定度uri=0.10μL。

比對結果采用比對判據En值進行評價，En值又稱為歸一化偏差，為各實驗室比對結果與參考值的差值與該差值不確定度之比，其評判原則是：|En|≤1參比實驗室測量結果與參考值之差在合理的預期范圍之內，比對結果可以接受。

(6)

因各參比實驗室測量結果相互無關，因此ui按式(7)計算：

(7)

通過以上公式可以得出NIM所提交的測量結果的En值為0.85，因此按評判原則，本次比對所提交的測量結果為有效比對值，如圖2所示，同時也可以證明本次比對NIM所提交的校準數據是準確有效的。

圖2 比對結果匯總圖

經過以上分析及計算之后，各參比實驗室校準數據及擴展不確定度詳見表3。

表3測量結果及不確定度匯總表

5 結束語

通過比對發現大氣壓力對移液器的校準結果有著較大影響，經過修正后各參比實驗室的校準結果有了較好的一致性；同時經過對移液器的分析和數學模型的研究得出，由于其自身結構存在不穩定性所帶入的不確定度分量是不確定度分析中的一個主要來源。本次比對證明用于微量容積值計算及不確定度分析的數學模型其算法準確、結果可靠，很好地解決了移液器在日常檢定及校準中的數據處理問題。

[1] 劉子勇. 容量計量[M]. 北京:中國計量出版社，2009

[2] Tanaka, M., et. Al.Recommended table for the density of water between 0 ℃ and 40℃ based on recent experime ntal reports.Metrologia, 2001, 38：301-309

[3] ISO4787:2010 Laboratory glassware-Volumetric glassware-Methods for use and testing of capacity[S]

[4] ISO8655-1/2/6:2002 Piston-operated volumetric apparatus[S]

[5] S Lorefice.Traceability and uncertainty analysis in volume measurements[J]. Measurement，2009,42:1510-1515

[6] JJF 1059—1999 測量不確定度評定與表示[S]

[7] 佟林,王金濤,劉子勇. 移液器使用及校準過程中影響因素分析[J].中國計量，2012(5):79-81