末端病大鼠跟腱修復中膠原表達的研究

張 林，沈勇偉，齊紅梅

末端病的發病率在運動員中較高，其多發在四肢遠端及關節部位，其中又以跟腱末端病患者居多。跟腱末端區的結構比較復雜，其病變呈現多樣性，使得眾多學者對于末端病的認識不統一，因而末端病的發病機制尚無定論。跟腱病變是末端結構的主要病變，而肌腱是乏細胞和乏血管的組織，代謝慢，愈合也較慢，而且通常是瘢痕愈合，因此損傷的肌腱可能不能恢復到健康和正常的肌腱功能水平。盡管近年來對肌腱損傷修復的研究有了一定的進展，但在臨床上尚未找到預防和治療肌腱損傷的特效方法，為了彌補肌腱低效率的愈合過程，很多研究者嘗試了各種治療策略。由于人們逐漸認識到肌腱具有一定的代謝活動和良好的適應能力，因此通過對肌腱損傷機制的研究，能為肌腱損傷的修復提供重要的理論依據。本實驗以末端病大鼠為實驗對象，通過觀察末端病大鼠跟腱修復過程中膠原I和膠原III基因表達和蛋白含量的動態變化，探討膠原在末端病大鼠跟腱修復中的作用及其機制，為完善末端病的發病機制及促進肌腱損傷的恢復提供實驗依據。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗材料

4周齡健康清潔級雄性Wistar大鼠56只（由蘇州大學動物實驗中心提供），均體重為（108±7.8）g，適應性喂養一周后隨機分組：（1）空白對照組（N=8）；（2）模型對照組（N=8）；（3）模型自然愈合組40只，按取材時間點不同分為1 d組、2 d組、3 d組、7 d組、14 d組，每組8只。實驗動物分組情況見表1。

Wistar大鼠每籠4只進行飼養，自由進食與飲水，用國家標準嚙齒類動物飼料進行喂養。保持動物房溫度為18～24℃、相對濕度為45%～55%，充足的自然光照。

表1 實驗動物分組TableⅠ Groups of the Rats for Experiment

1.2 研究方法

1.2.1 造模方法

用電刺激跳躍法造模：造模組的大鼠放在造模裝置里，每15 s通電一次，共持續20 min，休息10 min，再持續20 min。每天造模1次，每周6次，持續5周。通電電壓由小逐步加大，直到大鼠出現有效跳躍為止，一般在50 V左右，個別情況下達到80～100 V。

1.2.2 指標測試方法

（1）ELISA法測定跟腱內膠原I和膠原III的含量。

（2）實時定量PCR方法測定跟腱內膠原ImRNA和膠原IIImRNA的表達情況。

1.2.3 統計分析

結果采用平均數±標準差（X±SD）表示，所有數據用SPSS17.0統計軟件包處理，采用方差分析，顯著性水準為0.05。

2 實驗結果

2.1 大鼠跟腱膠原I測試結果

2.1.1 跟腱末端病模型對照組與正常對照組比較

模型對照組與正常對照組比較，膠原ImRNA的表達和膠原I蛋白的合成量明顯下降，且具有統計學顯著性意義（見表2）。

表2 正常對照組與跟腱末端病模型對照組膠原I合成量比較(N=8)TableⅡ Comparison between the Quantity of Collagen-I Synthesis of the Control Group and the Group of Achilles Tendon Enthesiopathy Model (N=8 )

2.1.2 跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原ImRNA和膠原I蛋白含量變化

測試結果顯示，隨著愈合時間的延長，跟腱末端病模型自然愈合組的膠原ImRNA的表達逐漸增加。與造模對照組比較，自然愈合1 d組、2 d組、3 d組、7 d組都沒有顯著性的差異（P＞0.05）。

膠原I的變化出現了先小幅降低而后增加的過程（見表3）。在自然愈合組，與造模對照組相比，第1 d、2 d、3 d、7 d膠原Ⅰ呈下降的趨勢，直到第14 d才出現顯著性增加（P＜0.05），提示在第14 d時，膠原I參與跟腱修復能力顯著增強。

表3 膠原I m R N A表達和膠原I蛋白含量變化TableⅢ Collagen-ImRNA Expression and Protein Content Variation of Collagen-I (N=8 )

2.2 大鼠跟腱膠原III測試結果

2.2.1 模型對照組與正常對照組大鼠跟腱膠原IIImRNA和膠原III合成量

跟腱末端病模型對照組與正常對照組比較，模型對照組大鼠跟腱膠原IIImRNA表達迅速上調，膠原III的合成量增加，兩者與正常對照組比較均具顯著性差異（P＜0.05）。測試結果如表4。

表4 正常對照組與造模對照組膠原IIIm R N A和膠原III合成量比較 (N=8)TableⅣ Comparison between Collagen-IIImRNA and the Quantity of Collagen-III Synthesis of the Control Group and the Model Group(N=8 )

2.2.2 跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原IIImRNA和膠原III蛋白含量變化

由測試結果發現，跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原III變化規律是：隨著愈合時間的推移，膠原IIImRNA的表達和膠原III的合成呈現先升高后降低的趨勢。

跟腱末端病自然愈合組大鼠與造模對照組大鼠比較，第1 d、2 d、3 d，跟腱膠原IIImRNA表達和膠原III的含量逐漸增加，差異非常顯著（P＜0.01），此后膠原IIImRNA表達開始迅速增加，并在第7 d達到峰值（P＜0.01），之后開始下降，但在第14 d仍高于對照組（P＜0.05），而膠原III的合成仍顯著增加（P＜0.05），至14 d增加非常明顯（P＜0.01）。測試結果如表5。

3 討論

3.1 末端病大鼠跟腱膠原ImR NA和膠原I蛋白含量變化規律

膠原I是肌腱細胞外基質強度的重要承擔著，其含量占肌腱干重的60%左右，在正常肌腱的膠原中占95%，另外5%為膠原III及少量的V型。膠原I的結構是由排列緊密的粗膠原原纖維組成，因而具有強度大彈性低的特點，起穩定組織的作用。跟腱的功能主要靠膠原來維持，因此測定膠原I含量的變化能較好地反應跟腱的機能狀態。

表5 膠原I I I m R N A表達和膠原I I I含量變化的比較TableⅤ Comparison between Collagen-IIImRNA Expression and Content Variation of Collagen-III (N=8 )

有關運動訓練對肌腱膠原I含量及其基因表達影響的研究已見報道。Olesen等[1]通過去除腓腸肌和比目魚肌及部分跟腱后給跖肌牽拉，并測定加載后1 d、2 d、4 d、8 d和16 d后跖肌腱中前膠原Iα1 mRNA的水平，結果發現1 d后前膠原Iα1 mRNA水平顯著降低，在8 d和16 d后其表達顯著上升，前膠原Iα1 mRNA降低的具體機制目前還不清楚，可能與其開始載荷時其降解有關，其后基因水平的上調表明在8 d、16 d后膠原I和合成加快，有利于受損肌腱的修復。李敏[2]的研究表明，一次性跑臺運動后即刻、12 h、72 h時前膠原I α 1 mRNA水平與對照組相比無顯著性變化，表明一次性跑臺運動不能在轉錄水平上上調肌腱膠原Ⅰ的表達，在轉錄水平上上調肌腱膠原I的合成，可能需要較大的強度負荷和時間負荷。但在一次性跑臺后即刻和12 h時跟腱中膠原I蛋白含量顯著降低，表明一次性跑臺后可抑制跟腱膠原的合成，其原因可能是由于不適應負荷作用下暫時的抑制或清除膠原的能力的增加，也可能是運動時肌腱腱周液體的溢出等緣故。因而他們的研究結果具有相同的觀點：在運動載荷后12 h內膠原I的合成被抑制。本研究中末端病大鼠跟腱內的膠原ImRNA表達和膠原I含量明顯下降，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明末端病大鼠跟腱膠原Ⅰ在轉錄水平上的表達和蛋白水平的合成量都下降，這正說明膠原代謝被抑制，分析其原因，筆者認為在造模過程中過載的負荷誘導腱細胞的凋亡以及膠原合成和分泌被抑制所致，也可能是受損的跟腱破裂造成膠原流失的原因。因此本研究的結果表明在造模后膠原I水平的下降與上述的報道是一致的。

從末端病大鼠跟腱中膠原I蛋白和膠原ImRNA的表達動態變化來看，隨著時間的推移，跟腱中的膠原ImRNA的表達逐漸增加，但膠原I蛋白的合成第1 d、2 d、3 d出現了小幅下降，隨后開始逐漸增加，說明受損跟腱恢復早期膠原I合成代謝被抑制，這和李敏[2]的研究結果相一致，但是在隨后的恢復過程中這種抑制作用逐漸減弱，表現出隨時間增加而逐步增長的規律，也預示著被受損的跟腱逐漸被修復的過程。造成這種變化的原因，筆者認為，其一是在恢復早期，受損的跟腱中膠原合成代謝被不適宜的運動載荷的抑制未被解除。二是膠原I合成代謝被其它因素的制約，包括：（1）可能是膠原III合成的快速增加代償了膠原Ⅰ的下降；（2）酶活性的改變，如MMP-1 mRNA的表達和MMP-1蛋白含量的明顯增加導致膠原降解；（3）細胞因子的激活，如TGF-β 1具有明顯的促進膠原合成的作用；（4）某些代謝產物增多等。三是膠原從受損的肌腱中溢出等。這些原因造成了膠原的含量出現暫時下降的現象，但隨著載荷取消后恢復時間的延長，跟腱中血液供應逐步得到恢復，腱細胞又被激活，合成和分泌到基質中的膠原蛋白和蛋白多糖也增多，從而穩固了肌腱組織的結構，有利于肌腱的重塑。

3.2 末端病大鼠跟腱膠原IIImR NA和膠原III蛋白含量變化規律

與膠原I相比，肌腱中膠原III的含量很少，不足10%，其形成的纖維與膠原I明顯不同，纖維較細但彈性較高。肌腱中膠原III主要分布在腱內膜和腱鞘，也分布在衰老的肌腱或承受高應力肌腱的附著處。Eriksen等的研究表明，當肌腱受到損傷進行修復時，會出現膠原Ⅲ的暫時表達［3］，從而促進膠原III的合成，膠原III合成的增加是組織代謝活躍的標志［4］，因而可用膠原III代謝水平的變化來評價肌腱的功能狀態。

有關末端病大鼠跟腱對膠原III表達的研究至今未見報道。但運動訓練對跟腱膠原III影響的研究已有相關的報道。李敏［2］在研究一次性跑臺運動對大鼠跟腱影響時發現，運動后24 h膠原III含量開始增加，至72 h顯著增加，膠原III型α 1鏈在轉錄后水平也顯著增加，而膠原III合成的增加標志著組織代謝的活躍，提示一次性跑臺后跟腱組織內代謝活躍，它可刺激跟腱在轉錄前或后水平上調膠原III的合成和裝配。任洪峰［5］對大鼠進行為期8周的中等強度的強化訓練，并用免疫組化方法測定其訓練1周、2周后跟腱膠原III的表達，結果顯示在第1周膠原III含量升高。這表明運動刺激促進膠原III的表達呈現訓練早期增強，訓練早期膠原III的含量增加提示應力作用下膠原代謝活動加速，促進組織結構發生改建。Olesen等［1］通過去除腓腸肌和比目魚肌及部分跟腱后給跖肌加載，研究加載后2 d、4 d、8 d和16 d后跖肌腱中前膠原IIIα2 mRNA的水平，結果發現1 d后其表達顯著增加，同樣表明膠原Ⅲ在運動載荷后早期表達增加。艾進偉［6］的研究發現中等強度的負荷沒有引起膠原III含量的顯著性變化，但強化訓練組豚鼠跟腱膠原III含量顯著增加，與前述不一致，提示運動后引起肌腱組織中膠原III與應激的強度有關。以上研究的結果雖然有所不同，但大多數的研究都支持了運動載荷導致跟腱中膠原III在早期表達增加的觀點。本研究結果顯示，末端病大鼠造模后跟腱中無論是膠原IIImRNA在轉錄水平的表達還是膠原Ⅲ在蛋白水平的合成都表現出明顯增加，且具有顯著性差異（P＜0.05），提示在受損跟腱中膠原III的表達增加，與上述的運動引起早期階段膠原III含量增加的結果相一致。作者認為，末端病大鼠跟腱膠原III表達的提高與運動后早期引起膠原III表達增加具有相同的原因，可能是運動應激增加了跟腱內的損傷速率，限制了膠原原纖維自我裝配的末端肽的切除，使原膠原III快速形成分子內、分子間交聯，從而快速合成膠原原纖維，加上分子間雙硫鍵的存在，對肌腱內組織起著堅實的固定作用，因此重塑性膠原III合成的增加預示著組織修復的增強。

末端病大鼠跟腱中膠原III變化規律呈現先升高后降低的趨勢。造模后大鼠跟腱膠原IIImRNA表達迅速上調，膠原III的合成量也增加，兩者與對照組相比都具有顯著性的差異（P＜0.05），第1 d、2 d、3 d，膠原IIImRNA表達和膠原III的含量逐漸增加，與對照組相比，差異非常顯著（P＜0.01），此后膠原IIImRNA表達開始迅速增加，并在第7 d達到峰值（P＜0.01），之后開始下降，但在第14 d仍高于對照組（P＜0.05），而膠原III的合成仍顯著增加（P＜0.05），至14 d增加還是明顯（P＜0.05）。這種變化也說明膠原Ⅲ在跟腱修復的早期階段起著十分重要的作用，與上述相關研究的結果和觀點相一致。

4 結論

4.1 在末端病大鼠跟腱早期修復過程中膠原I的表達被抑制。

4.2 在末端病大鼠跟腱修復的早期階段膠原III起著十分重要的作用，這種作用在修復的前7 d效果非常明顯。

4.3 末端病大鼠跟腱修復初期膠原III能代償被抑制合成的膠原I，積極參與肌腱的再生，直至膠原I代謝被激活后，兩者共同促進肌腱的修復。

[1]Olesen JL,Heinemeier KM,Haddad F, et al. (2006). Expression of insulin-like growth factor I,insulin-like growth factor binding proteins,and collagen mRNA in mechanically loaded plantaris tendon.[J ]. Appl Physiol,101(1):183-188.

[2]李敏.跑臺運動對大鼠跟腱的及其機制研究[D].中國學位論文全文數據庫.2008

[3]Eriksen HA, Plajala A, Leppilahti J, et al. (2002). Increased content of type Ⅲ Collagen at the rupture site of human Achilles tendon[J ]. J Orthop Re, 20(6):1352-1357.

[4]艾進偉.強化訓練隊跟腱塑形改建影響的動物實驗和人群干預研究[D]. 中國學位論文全文數據庫.2005

[5]任洪峰.不同訓練方式對大鼠跟腱改建影響的實驗研究[D].中國學位論文全文數據庫.2005

[6]艾進偉,黃昌林,呂榮,等. 制動對豚鼠跟腱基質的影響[J]. 中國骨與關節損傷雜志, 2005，（05）：123-126.