羊睪丸原代細胞傳代試驗

張玉紅，何玉仙，井蓮娜，王玉紅

（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011）

羊睪丸原代細胞傳代試驗

張玉紅，何玉仙，井蓮娜，王玉紅

（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011）

生產山羊痘活疫苗時，羊睪丸采集工作量大，易污染，費時費事，是否有辦法減少人員外出采集羊睪丸次數，值得摸索，本實驗將長成單層的羊睪丸細胞進行傳代，長成致密單層后進行接毒，收獲毒液，并對毒液及疫苗成品進行病毒含量測定，結果表明，羊睪丸細胞完全可以傳一代，細胞形態良好，毒液、疫苗成品毒價均達到規程要求，羊睪丸原代細胞傳代可以大大提高睪丸組織利用率，降低人員勞動強度。

羊痘疫苗；原代細胞；傳代

羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是由山羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CPV)的痘病毒引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,主要表現為發熱，無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發生丘疹和皰疹。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為A類疾病，我國將其列為一類動物疫病[1]。此外，還有人類感染羊痘的報道，世界各國都重視本病[2]。皮膚是病毒復制的主要場所[3]。本病只有羊感染發病，根據臨床癥狀，結合其流行病學特征，就可以做出初步診斷。實驗室診斷方法有多種，如病毒培養分離法、病毒中和試驗(VN)、瓊脂擴散試驗(AGID)、對流免疫電泳(CIEP)乳膠凝集試驗、ELISA實驗、Western印跡實驗、熒光抗體實驗和間接熒光抗體試驗等[4]。

1 材料與方法

1.1 羊睪丸細胞傳代試驗

1.1.1 羊睪丸組織

烏魯木齊市郊區個體養殖戶處采集4月齡以內的健康雄性綿羊羔羊睪丸。

1.1.2 健康細胞

由本公司羊痘生產組提供生長良好的健康的羊睪丸原代細胞。

1.1.3 種毒

山羊痘睪丸細胞培養弱毒株STV42，1983年9月16日凍干，各項指標符合獸用生物制品制造規程[5]要求，由中國獸藥監察所提供，由本廠羊痘生產組連續傳代2次進行種毒適應和復壯，隨后直接通過轉瓶培養，按照含1%～2%的毒種的細胞維持液生產的毒液用作種毒，凍干保存。按規程檢驗各項指標符合規程中種毒要求。

1.1.4 儀器與設備

冰箱（海爾公司BCD216TDZA）、倒置顯微鏡（PULL公司生產的BDS-300）、計數板、水浴箱、15 000 mL血清瓶等均為國產。

1.1.5 方法

將生長良好的健康綿羊羔睪丸原代細胞，倒去生長液，加入原生長液量1/10的預熱的0.25%胰酶進行消化，待細胞層呈雪花狀時，倒去胰酶，先用少許生長液搖下細胞，然后按1∶2的分種率，補足生長液，混勻、分裝，37℃旋轉培養，觀察細胞形態，待細胞長成單層后，接入含有1%～2%種毒的乳漢液，觀察細胞病變（CPE）達75%時凍結，再融化刮一次，共凍融兩次，每次一個大轉消化后分瓶的兩個大轉收的毒液混為一組，分別依上述方式重復6次試驗。

1.2 羊睪丸原代細胞制備試驗

按獸用生物制品制造規程要求選用四月齡以內的健康雄性綿羊，無菌摘取睪丸，剝棄白膜鞘膜，稱取12 g睪丸組織，剪碎、漂洗、消化、分散，收集乳漢液定量1 500 mL細胞液分裝于一個大轉，細胞充分搖勻，于37℃溫室旋轉培養。，觀察細胞形態。待細胞長成單層后，接入含有1%～2%種毒的乳漢液，觀察細胞病變（CPE）達75%時凍結，再融化刮一次，共凍融兩次，每次一個大轉為一組，分別依上述方式重復6次試驗。

1.3 毒液半成品、成品的病毒含量（TCID50）的測定

將上述2組病毒液的樣品進行無檢并用細胞測毒法檢測病毒含量（TCID50/mL）。將上述2組病毒液制成的成品樣進行無檢并測定疫苗中的病毒含量（TCID50/頭份）。

2 結果

2.1 原代細胞傳代一代后試驗結果

原代細胞與傳代細胞實驗結果比較,可以看出原代細胞經胰酶消化傳代一代的細胞長成單層所用的時間在四天左右,與原代細胞長成單層的時間差別不明顯，結果見表1。

表1 傳代一代的細胞與原代細胞長成單層所用的時間對比情況

2.2 傳代一代的病毒液半成品的病毒含量測定

原代細胞與傳代細胞實驗結果比較,傳代細胞獲得的病毒液半成品病毒含量TCID50=106.1,符合規程要求的半成品TCID50》5.5要求,與原代細胞半成品毒價檢測結果差別不明顯,結果見表2。

表2 傳代細胞與原代細胞半成品及成品病毒含量測定對比情況

2.3 傳一代獲得的成品疫苗的效力檢驗

效力檢驗用羊檢驗，將成品疫苗用生理鹽水稀釋成0.5 mL含0.01個使用劑量，胸腹部皮內注射山羊3只，每只2顆，每顆0.5 mL，觀察15 d。在接種后5～7 d應至少有2只山羊出現直徑為0.5～3 cm微紫紅色或無色痘腫反應，且持續4 d以上，逐漸消退。發痘羊間或可有輕度體溫反應，但精神食欲正常。試驗發痘情況見表3。其它體征均正常,結果表明原代細胞與傳代細胞效檢均達到規程要求。

表3 傳代細胞與原代細胞成品效力檢驗對比情況

3 討論

從羊睪丸原代細胞傳代一代結果可以看出，傳代一代細胞形態正常，細胞傳代一代的半成品、成品毒價均達到規程要求，說明羊睪丸原代細胞進行傳代完全是可行的。目前僅傳了一代。

由表4可以看出，同樣制備3 000 mL毒液，原代細胞與傳代細胞長成單層的時間差別不大，因此傳代與不傳代的生產周期基本一樣，進行傳代可以減少一倍人員外出采集睪丸的次數，大大降低人員勞動強度，進行傳代可以減少一半的睪丸用量，提高了睪丸組織的利用率，從表4可見，原代細胞的成本低于傳代細胞，但原代細胞人員比傳代細胞要多一倍，加上人員的費用二者成本差異不顯著。選擇何種方式進行生產完全在于生產者本身的出發點。

表4 原代細胞與傳代細胞經濟效益對比

本實驗僅僅將羊睪丸原代細胞傳了一代，是否能繼續往下傳，能傳幾代，傳代后的細胞形態如何，而且傳代后的半成品、成品毒價如何，都有待于進一步去跟進。

羊睪丸原代細胞傳代一代的成功也為其它原代細胞如豬瘟細胞苗的傳代奠定了技術基礎。

[1]CRAN V M.Control of capripoxvirus infection[J].Vaccine,1993,11(3):1275-1279.

[2]洪艷，謝忠文，施恒豫.人感染山羊痘5例[J].中華傳染病雜志,2005,23(2):143.

[3]BOWDEN TR BABIUK S L PARKYN G R et a.l Capripoxvirus tissue tropism and shedding:A quantitative study in experimentally infected sheep and goats[J].Virology,2008,371(2):380-393.

[4]徐維加，等.羊痘診斷與預防的研究進展[J].畜牧獸醫科技2007，（3）：4-5.

[5]中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸醫生物制品規程(2000年)[M].北京:化學工業出版社, 2000:142.

Subculture of Sheep Testicular Primary Cells

ZHANG Yu-hong，HE Yu-xian,JIN Lian-na,WANG Yu-hong
（Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830011，China）

when we produce goat pox vaccine,sheep testicles acquisition is a heavy job which was easily contaminated,time-consuming and cumbersome.Whether there are some ways to reduce our staff go out to collect sheep testicles,is worth fumble.In this experiment,a monolayer of sheep testicular cells were passaged so as to grow into a dense monolayer after inoculation,and to harvest venom,and measured the dose of virus. The results show that sheep testicular cells completely could subculture to one generation,and the cell morphology is satisfied to do next experiment,the venom and the final vaccine titer reached our requirements. Culture of generated cells can greatly improve working efficiency,and could reduce labor intensity.

goat pox vaccine;primary cells

S852.5

A

1003－6377（2013）03－0057-03

2013-02-11

張玉紅（1971-），女，獸醫師，主要從事疫苗生產工作。