UPLC－MS/MS法測定豬肉中萬古霉素與去甲萬古霉素

冼燕萍，陳立偉，羅海英，郭新東，吳玉鑾，羅東輝，侯向昶

(廣州市質量監督檢測研究院 國家加工食品質量監督檢驗中心(廣州) 廣州市食品安全檢測技術重點實驗室

廣州市食品安全風險動態監測與預警研究中心，廣東 廣州 510110)

萬古霉素和去甲萬古霉素(結構式如圖1所示)屬于糖肽類抗生素，常用于治療細菌感染。農業部第560號公告規定萬古霉素為禁用獸藥［1］，如果這類藥物被違規濫用于動物的養殖，很可能因其耐藥性問題而影響動物性食品的安全、公共衛生以及出口貿易，長期食用則有可能導致消費者產生更嚴重的抗生素耐藥性。萬古霉素被列入衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第1－5批匯總)》，并注明“需要研制動物性食品中測定萬古霉素的液相色譜－串聯質譜法”［2］。因此，開展動物性食品中萬古霉素等糖肽類抗生素殘留量的檢測技術研究迫在眉睫。

國內外關于萬古霉素等糖肽類抗生素［3－14］的檢測方法有高效液相色譜法［5－8］、高效液相色譜－質譜聯用法［9－14］，但檢測對象多為血液樣品［5－8］，而關于食品中萬古霉素的分析方法報道較少。劉佳佳等［10］采用液質聯用法檢測了牛奶中萬古霉素的含量。本文建立了豬肉中萬古霉素和去甲萬古霉素的超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜(UPLC－MS/MS)檢測方法，方法簡便快速、靈敏度高、重現性好、實用性強，可為政府進一步打擊違法添加非食用物質和推動食品安全標準體系的完善提供技術支持。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素的化學結構式Fig.1 Chemical structures of vancomycin and norvancomycin

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTMTQ MS三重四極桿串聯質譜儀(美國Waters公司);高速離心機5804R(德國Eppendorf公司);T18均質器、MS3 Basic漩渦混合器(德國IKA公司);KQ－250DV型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);N－EVAP 112水浴氮吹儀(美國OA公司);Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司);固相萃取裝置(美國Waters公司);LC－C18固相萃取小柱(CNW公司，200 mg/3 mL):臨用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，3 mL 0.1%甲酸水－乙腈(9∶1，體積比)平衡。

萬古霉素(含量95%，Sigma公司);去甲萬古霉素(含量83.4%，中國藥品生物制品檢定所);甲醇和乙腈(HPLC級，德國Merck公司)，甲酸(HPLC級，CNW公司)，正己烷(分析純，廣州化學試劑廠)，超純水(18.2 MΩ)。10例豬肉樣品均購于本地市場。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取萬古霉素和去甲萬古霉素標準品，用0.1%甲酸水溶液配成100 mg/L的單標標準儲備液，4℃冰箱保存。

根據需要，用經前處理所得的陰性樣品基質溶液配成不同濃度的系列基質匹配混合校準工作液，當天配制。以基質匹配校準工作曲線進行定量。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取 稱取已均質的試樣5.0 g(精確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中，加入5 mL 0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)，渦漩3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液于10 mL比色管中，重復提取1次，合并上清液，定容至10 mL。取5 mL提取液于15 mL塑料離心管中，加入5 mL正己烷(乙腈飽和)，渦漩2 min，12 000 r/min離心3 min，棄去正己烷層，重復用正己烷脫脂1次，下層提取液待凈化。

1.3.2 凈 化 吸取2.0 mL待凈化液于試管中，加入4.0 mL 0.1%甲酸水，混勻，加入已活化的LC－C18固相萃取小柱中，控制流速不大于1 mL/min，待液體全部流出后，分別用2 mL 0.1%甲酸水－乙腈(9∶1)溶液和1 mL 50%甲醇潤洗試管，轉入小柱，棄去淋洗液，然后用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用0.1%甲酸水－乙腈(9∶1)溶解，轉移、定容至1.0 mL，樣液過0.22 μm濾膜后，供UPLC－MS/MS分析。

1.4 UPLC－MS/MS檢測條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流動相:A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫程序:0.0～0.5 min，95%A;0.5～1.5 min，95%～85%A;1.5～3.0 min，85%～75%A;3.0～3.1 min，75%～95%A;3.1～5.0 min，95%A;流速:0.25 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:5 μL。

質譜條件:ESI正模式;毛細管電壓1.0 kV;離子源溫度150℃;去溶劑氣溫度500℃;去溶劑氣:氮氣，流速800 L/h;錐孔氣:氮氣，流速50 L/h;碰撞氣:高純氬氣，流速0.2 mL/min;檢測模式:多反應監測(MRM)模式;2種化合物的監測離子對(m/z)、豐度比及其它優化的質譜參數(錐孔電壓、碰撞能等)見表1，每個離子對的駐留時間均為0.1 s。

表1 目標化合物的質譜分析條件Table 1 MS parameters for the analysis of vancomycin and norvancomycin

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

萬古霉素和去甲萬古霉素均含有一個二氯三苯基醚結構單元、兩個糖基和多個氨基酸，去甲萬古霉素比萬古霉素少1個甲基，兩者的分子量分別為1 449和1 435。在一級質譜中，易與H+結合，產生帶正電的雙電荷離子［M+H］2+，質譜圖上呈現m/z 725.6和m/z 718.1，以此作為萬古霉素和去甲萬古霉素的母離子，并優化錐孔電壓，使母離子強度最大。帶多電荷的母離子進入二級質譜后，發生斷裂或重排等反應產生不同的碎片離子，優化碰撞電壓，使每種化合物的主要特征碎片離子的強度達到最大，并以豐度最大的兩個碎片離子作為定性與定量離子。2種目標物的子離子掃描質譜圖如圖2所示，特征離子對和電離條件、碰撞條件見表1。

圖2 萬古霉素(A)和去甲萬古霉素(B)的子離子掃描圖Fig.2 Daughter scan spectra of vancomycin(A)and norvancomycin(B)

2.2 色譜條件的優化

在流動相中加入甲酸，可以為目標化合物提供必需的質子來源，提高離子化效率。用等度洗脫或梯度洗脫變化太快時，由于萬古霉素和去甲萬古霉素的結構僅相差1個甲基，二者不能完全分離。采用“1.4”所示的梯度洗脫，可將2種目標物分離，萬古霉素和去甲萬古霉素的保留時間分別為2.72 min和2.64 min，目標物混合標準溶液(5.0 μg/L)的總離子流圖(TIC)和提取離子色譜圖見圖3。

圖3 萬古霉素和去甲萬古霉素混合標準溶液(5.0 μg/L)的總離子流圖(A)和提取離子色譜圖(B～C)Fig.3 Total ion chromatogram(A)and selective ion chromatograms of norvancomycin(B)and vancomycin(C)mixture standard(5.0 μg/L)

2.3 前處理條件的確定

萬古霉素和去甲萬古霉素均為兩性化合物且結構中含有多個羥基，故易溶于水，微溶于甲醇等有機溶劑。本實驗在陰性豬肉樣品中添加10 μg/kg的混合標準溶液，對比了以甲醇、乙腈、水、0.1%甲酸水、0.1%甲酸水－乙腈(1∶1)作為提取溶劑的提取效果。結果顯示，以純有機溶劑提取時，提取液澄清，但因溶解度問題，回收率偏低;以純水相提取時，提取液渾濁，難以離心分離或過濾膜，造成后續凈化困難;以0.1%甲酸水－乙腈(1∶1)提取時，提取液較澄清，回收率較高，但提取液中2種化合物的響應值比純溶劑標準溶液的響應值高，計算得到的回收率均超過100%，說明存在基質效應。因此，本文在進一步比較不同體積比0.1%甲酸水－乙腈混合體系的提取效果時，均與相應的基質匹配標準溶液進行比較，回收率計算結果見圖4?？梢?，0.1%甲酸水的體積分數為50%、60%和70%時，提取效果較好。

圖4 不同配比提取溶劑的提取回收率Fig.4 Comparison of recoveries of extraction solution with different proportions

本文先采用正己烷除去提取液中的脂肪類等非極性雜質。由于動物肌肉組織基質比較復雜，提取液中還含有其它的共萃取雜質干擾檢測，并對檢測儀器產生一定的污染，因此需進一步凈化處理。根據目標物的結構性質，對比了ENVI－Carb(Supelclean，500 mg/6 mL)、Strata － x(Phenomenex，200 mg/3 mL)和LC－C18(CNW，200 mg/3 mL)3種反相固相萃取小柱的凈化效果。根據圖4，提取效果較好的提取溶劑體系至少含有30%乙腈，此時若直接上樣，待測物會直接從反相固相萃取小柱上流出。因此，比較了上樣溶液中乙腈含量分別為0%、5%、10%、20%和30%的情況，分別以上述5種配比的0.1%甲酸水－乙腈混合溶液配制10 μg/L待測物混合標準溶液，各取2 mL加入3種預先用甲醇、水活化的固相萃取小柱中，以2 mL對應比例的甲酸水－乙腈溶液淋洗后再以1 mL 50%甲醇淋洗，8 mL甲醇洗脫，收集各個步驟的流出液進行檢測，計算回收率(結果見圖5)。結果表明上樣溶液中乙腈的比例不高于10%時，LC－C18小柱的回收率最好(92%～101%)。

圖5 3種固相萃取小柱和不同配比加樣溶液的回收率Fig.5 Comparison of recoveries of different SPE and sample solution

綜上，本實驗選擇0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)作為提取溶劑，然后取2.0 mL提取液加入4.0 mL 0.1%甲酸水，將乙腈的比例釋釋至10%，再用LC－C18小柱凈化。

2.4 基質效應、線性關系與檢出限

采用LC－MS/MS檢測復雜基質樣品時，常出現基質效應，影響定量分析的準確度和精密度［15］。Matusewski等［16］建立了基質效應的確認方法，即比較陰性基質匹配標準溶液和純溶劑標準溶液響應值的差異:當比值等于或接近1時，表明不存在基質效應的影響;大于1時，表明存在離子增強作用，反之則表明存在離子抑制作用。

本實驗配制濃度范圍為0～50 μg/L的系列基質匹配校準工作溶液和純溶劑標準溶液進行同時測定，分別繪制標準曲線，通過計算基質校準曲線斜率與純溶劑標準曲線斜率的比值來考察方法的基質效應。結果發現:萬古霉素的斜率比值為2.36，去甲萬古霉素的斜率比值為1.85，說明存在基質增強效應。在實驗中雖嘗試采用改善樣品前處理［17］以及色譜或質譜條件［18］等手段來減小基質效應，但未獲得明顯效果，因此采用陰性基質匹配校準溶液進行定量分析。

2種待測物在陰性豬肉基質中的線性方程、線性范圍、相關系數見表2，萬古霉素和去甲萬古霉素在1～50 μg/L范圍內線性關系良好，其相關系數(r2)均大于0.99;檢出限(LOD，S/N=3)分別為0.5 μg/kg和0.3 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為2.0 μg/kg和1.0 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

表2 豬肉中2種目標物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 2 analytes in pork

圖6 不同樣品的TIC色譜圖(A～C)及提取離子色譜圖(D～E)Fig.6 Total ion chromatograms of different samples(A－C)and selective ion chromatograms(D－E)

2.5 方法的回收率與精密度

選取陰性豬肉樣品，按本實驗方法進行3個加標水平(LOQ、2LOQ、10LOQ)的回收率和精密度實驗，每個加標水平平行測定6次，計算其回收率和相對標準偏差。采用中間濃度的加標水平連續測定5 d，計算日間精密度，實驗結果見表3。2種目標物的平均回收率為80%～88%，日內相對標準偏差均不高于13.4%，日間相對標準偏差均不高于12.5%，表明方法的準確度和精密度良好?；旌蠘藴嗜芤旱腡IC圖、陰性豬肉樣品的TIC圖、添加水平為LOQ的陰性豬肉樣品的TIC圖及其提取離子色譜圖見圖6。

表3 豬肉的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and RSDs of 2 analytes in pork

2.6 實際樣品的檢測

采用本方法測定了本地市場銷售的10例豬肉樣品，均未檢出2種目標化合物。

3 結論

本實驗建立了超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜(UPLC－MS/MS)測定豬肉中萬古霉素和去甲萬古霉素的方法，以0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)混合體系協同提取，正己烷(乙腈飽和)和LC－C18固相萃取小柱凈化。優化了色譜、質譜和前處理條件，有效提高了檢測的靈敏度和準確度;方法具有良好的回收率和精密度，適用于豬肉中萬古霉素和去甲萬古霉素的同時檢測。

［1］ Ministry of Agriculture of the People s Republic of China Bulletin No.560《Local Standards of Veterinary Drugs Abolished Directory》．(2005 －10 －28)．［2005 －11 －01］．http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t2005111 7_496523.htm．

［2］ Ministry of Health of the People s Republic of China．Food May Be Illegal and Non-food Substances Added to the List of Food Additives Have Been Abused(1－5 Batches Summary)．(2011－04－19).［2011－04－22］．http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/ht mLfiles/mohwsjdj/s9164/201104/51441.htm．

［3］ Deng J J，Wei W.Journal of Military Surgeon in Southwest China(鄧晶晶，衛薇．西南軍醫)，2009，11(5):925－926．

［4］ Sun X Q，Li Z，Lin W X．Chin.J.Food Hyg.(孫興權，李哲，林維宣．中國食品衛生雜志)，2008，20(3):263－266．

［5］ Xiong L，Xin H W，Wu X C，Li Q，Yu A R，Shen Y，Su D．Military Med.J.South China(熊磊，辛華雯，吳笑春，李罄，余愛榮，沈楊，蘇丹．華南國防醫學雜志)，2009，23(6):7，11－13，18．

［6］ Zhang H F，Song Q，Dai B，Zhang F C．Pharmaceutical Journal of Chinese People s Liberation Army(張華峰，宋青，戴博，張福成．解放軍藥學學報)，2011，27(1):66－68．

［7］ Lin X L，Zhu J P，Fei Y．Chin.J.Clin.Pharm.(林秀麗，朱金平，費燕．中國臨床藥學雜志)，2011，21(4):231－234．

［8］ Xu X M．China J.Mod.Med.(徐幸民．中國現代醫學雜志)，2004，14(14):105－106．

［9］ Lin W X，Sun X Q，Tian M，Yu L，Chen X，Li Z．J.Instrum.Anal.(林維宣，孫興權，田苗，于靈，陳溪，李哲．分析測試學報)，2009，28(2):212－215．

［10］ Liu J J，Jin F，She Y X，Liu H B，Shi X M，Wang M，Wang J，Xu S Y．Chin.J.Anal.Chem.(劉佳佳，金芬，佘永新，劉洪斌，史曉梅，王淼，王靜，徐思遠．分析化學)，2011，39(5):652－657．

［11］ Curren W S S，King J W．J.Chromatogr.A，2002，954(2):41－49．

［12］ Inoue K，Mizuno Y，Yoshimi Y．Liquid Chromatogr.，2008，31(9):3871－3878．

［13］ Lin W X，Sun X Q，Tian M，Yu L，Xiao S S，Li Z．China Dairy Ind.(林維宣，孫興權，田苗，于靈，肖珊珊，李哲．中國乳品工業)，2009，37(3):46－48．

［14］ Su M，Ai L F，Duan W Z，Ha J．Chin.J.Anal.Lab.(蘇萌，艾連峰，段文仲，哈婧．分析試驗室)，2012，31(3):73－77．

［15］ Yao M K，Ma B L，Ma Y M．Chin.J.Pharm.Anal.(姚夢侃，馬秉亮，馬越鳴．藥物分析雜志)，2010，30(12):2436－2440．

［16］ Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez－Eng C M．Anal.Chem.，2003，75(13):3019－3030．

［17］ Hernando M D，Suarez－Barcena J M，Bueno M J，Garcia－Reyes J F，Fernandez－Alba A R．J.Chromatogr.A，2007，1155(1):62－73．

［18］ Dams R，Huestis M A，Lambert W E，Murphy C M．J.Am.Soc.Mass Spectrom．，2003，14(11):1290－1294．