海帶多糖純化及清除自由基活性研究

彭臻菲，方哲翔，劉 敏，張其清，*

(1.福州大學化學化工學院，福建福州 350108;2.福州大學生物和醫藥技術研究院，福建福州 350002)

海帶(Laminaria japonica)，又名昆布、江白菜，屬褐藻，分布于我國山東、遼寧、浙江、福建等沿海省區，是一種廣泛養殖的經濟型海藻。我國海帶的養殖規模和產量均居世界首位，海帶年產量占世界海帶年產量的90%。其中，福建省海帶養殖產量位居全國首位［1］。我國海帶產品主要以初級加工產品為主，海帶產品平均單價在600美元/t。而鄰國日本則注重開發海帶功能保健食品，其海帶產品平均單價是中國的3倍［2］。因此，提高海帶產品產值，解決制約海帶產業發展的高產、低值問題，是推動海帶養殖、生產、銷售良性健康發展的關鍵。多糖是海帶主要的生物活性物質之一，已有研究發現，海帶多糖具有抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、抗凝血以及抗腫瘤等方面的活性，預示著海帶多糖具有開發為藥品或功能保健品的潛能［3－7］。但是，目前海帶多糖生物活性的研究仍不夠系統，很多關于生物活性的報道選用的是純度低的海帶多糖，且缺乏結構分析和活性機制研究。本實驗立足福建海帶的資源優勢，制備純度較高的海帶多糖，對其結構進行分析，并在體外評價其自由基清除活性，為海帶功能性產品的研究與開發提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶多糖 本實驗室制備;S－300凝膠填料、葡聚糖Dextran T系列分子量標準品 均購自GE公司;D－木糖、D－半乳糖、D－甘露糖、D－鼠李糖、D－葡萄糖、D－阿拉伯糖、D－巖藻糖 均購自國藥集團;D－葡萄糖醛酸 Alfa Aesar公司產品;苯酚、濃硫酸、氯仿、氯化鈉、甲醇、PMP、三氟乙酸 均為國產分析純;乙腈 國產色譜純。

DBS自動部分收集器、HL2S恒流泵 上海滬西分析儀器有限公司;RE5210A旋轉濃縮儀 上海亞榮生化儀器廠;UV1600分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Agilent1100高效液相色譜 美國安捷倫公司;AFZ1001U超純水系統 艾科浦公司;TP114電子天平 賽多利斯公司;Nexus670紅外光譜儀 賽默飛世爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海帶多糖純化 海帶多糖的制備參考文獻8。海帶干粉經水提醇沉及DEAE－A25粗分后，得到海帶多糖粗組分，分別為高、中、低鹽組分，其中低鹽洗脫組分便于后處理，且具有較高的自由基清除活性［8］。取適量海帶多糖低鹽粗組分干粉，溶于去離子水，配成濃度為5mg/mL樣品溶液。經S－300凝膠層析分離，去離子水洗脫，流速為3mL/10min，苯酚－硫酸法測定各管多糖含量，收集合并各洗脫峰峰尖部分，經濃縮凍干后即得純化后多糖組分WPS－1－1和 WPS－1－2。

1.2.2 多糖相對分子量測定 取純化多糖樣品，溶于去離子水，微孔濾膜過濾，備用。

色譜條件:色譜柱為TSK－GEL(G5000 PWXL，7.8×300mm)，檢測器為ELSD800，流動相為去離子水，流速 0.5mL/min，柱溫 30℃，進樣量 25μL。

1.2.3 多糖的單糖組成測定 采用高效液相色譜法分析多糖的單糖組成，具體方法如下:稱取純化的多糖樣品，溶于去離子水配制成25mg/mL樣品溶液，量取100μL樣品溶液置安瓿瓶中，加入2mol/L三氟乙酸150μL，封口，110℃水解2h。冷卻至室溫后，加入200μL甲醇，氮氣吹干，重復操作2次，以除去未反應的三氟乙酸。加入超純水溶解水解物后，加入0.6mol/L氫氧化鈉溶液和0.4mol/L PMP－甲醇溶液，混勻后，于70℃水浴100min，冷卻至室溫，0.3mol/L鹽酸中和后，氯仿萃取，取水相進行液相色譜分析。

色譜條件:色譜柱為C18柱(Waters Cosmosil C18，4.6 ×250mm i.d.，5μm)，流動相為0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.7)－乙腈(83∶17)，流速 1mL/min，檢測波長254nm，柱溫30℃，進樣量20μL。

1.2.4 多糖紅外光譜測定 取純化多糖樣品5mg，KBr研磨壓片后，在4000～500cm－1波數范圍內進行紅外掃描。

1.2.5 多糖清除自由基活性測定

式中:Ai為樣品組吸光值;A0為對照組吸光值。

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除能力測定 利用Fenton反應產生·OH。分別于試管中加入 Tris－HCl緩沖液 1.0mL、番紅溶液 1.0mL、蒸餾水 1.0mL、EDTANa2－Fe2+溶液 0.5mL、多糖樣品溶液 0.5mL和H2O2溶液0.5mL，混勻，37℃水浴保溫30min，冷卻至室溫后于520nm處測定吸光度。對照組以0.5mL蒸餾水代替待測多糖樣品，空白組以1mL蒸餾水代替待測多糖樣品和EDTANa2－Fe2+溶液。計算海帶多糖對·OH清除率公式:

式中:ASample為加入樣品后的吸光值;A0為對照組的吸光值;A為空白組的吸光值。

2 結果與討論

2.1 海帶多糖純化

海帶多糖低鹽粗組分的純化結果見圖1。海帶多糖粗組分經S－300層析分離后得到兩個洗脫峰，分別命名為WPS－1－1和 WPS－1－2。其中，多糖洗脫峰WPS－1－1為主要洗脫組分。分別收集兩個洗脫峰峰尖部分，經濃縮、凍干，計算多糖洗脫組分WPS－1－1和 WPS－1－2 得率分別為 40%和 16.2%。初步測定1mg/mL濃度下WPS－1－1和WPS－1－2兩個洗脫組分對·OH清除活性，發現WPS－1－1對·OH清除率是 WPS－1－2的 2.5 倍。因此，選擇 WPS－1－1組分進行多糖結構分析和自由基清除活性研究。

圖1 海帶多糖S－300洗脫曲線Fig.1 Elusion curve of Laminaria japonica polysaccharide on S－300 chromatography

2.2 多糖純度鑒定

多糖純度指的是相似鏈長多糖分子的平均分布。通常需要采用至少2種方法進行多糖純度鑒定。本實驗分別采用高效液色譜法和瓊脂糖凝膠電泳法鑒定多糖純度。

由圖2可知，多糖組分WPS－1－1經高效液相色譜分離后呈單一的對稱峰，表明WPS－1－1為均一多糖組分。

圖2 WPS－1－1高效液相色譜分析Fig.2 HPLC analysis of WPS－1－1

由圖3可知，多糖組分WPS－1－1經瓊脂糖凝膠電泳分離后，甲苯胺藍染色結果顯示其呈單一斑點，表明WPS－1－1為均一多糖組分。因此，高效液相色譜和瓊脂糖凝膠電泳檢測結果均表明，WPS－1－1為均一的多糖組分。

表1 WPS－1－1 單糖組成(%)Table1 Monosaccharide composition of WPS－1－1(%)

圖3 WPS－1－1瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.3 Electrophoresis of WPS－1－1 on a garose gel

2.3 多糖相對分子量測定

取已知分子量的Dextran T系列標準品(分子量分別為10、70、150、500ku)進行高效液相色譜分析，記錄各分子量標準品的保留時間。以標準品柱內保留時間為橫坐標，相對分子量對數值為縱坐標，繪制分子量標準曲線，回歸得其方程為:y=－0.2778x+9.2743(R2=0.9962)，其中，y為分子量Mw對數值lgMw，x為保留時間(min)。將測得的 WPS－1－1柱內保留時間為15.207min，代入標準曲線方程，得其相對分子量為112ku。

2.4 多糖的單糖組成測定

海帶多糖純化組分WPS－1－1經酸解、PMP衍生化后，采用高效液相色譜分析，結果見表1。與標準單糖保留時間比對，海帶多糖純化組分WPS－1－1含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖、巖藻糖等單糖。其中，巖藻糖、木糖、半乳糖、甘露糖為主要單糖組分，其摩爾比為 6.9∶3.3∶1.5∶1。

2.5 多糖紅外光譜分析

海帶多糖純化組分WPS－1－1紅外掃描圖譜見圖4。紅外分析結果顯示，多糖純化組分WPS－1－1具有多糖類物質的特征吸收峰。在3350～3390cm－1之間出現一個寬峰，是糖分子內或分子間氫鍵伸縮振動結果;2935cm－1附近較弱的肩峰是C－H伸縮振動引起的;1648cm－1的吸收峰為C=O不對稱伸縮振動;1410～1420cm－1之間吸收峰是C－H的變角振動;1245～1255cm－1吸收峰與S=O伸縮振動有關，提示硫酸酯基的存在;1000～1200cm－1間的吸收峰是吡喃糖環的醚鍵和羥基的吸收峰［9］。895cm－1處吸收峰是吡喃糖β－型C－H變角振動，提示WPS－1－1組分含有β－糖苷鍵。

2.6 多糖清除自由基活性測定

圖4 WPS－1－1紅外光譜分析Fig.4 FT－IR spectra of WPS－1－1

本實驗體外評價了海帶多糖純化組分WPS－1－1的自由基清除活性。由圖5a可知，WPS－1－1對清除率與多糖濃度呈正相關。在濃度為0.1mg/mL時，其對清除率為18%，當濃度達到1mg/mL時，其對·清除率達到91.7%，與相同濃度下 VC對清除率相當。WPS－1－1對·OH 清除活性實驗結果見圖5b。隨著 WPS－1－1作用濃度的增大，其對·OH清除活性逐漸增強。當 WPS－1－1濃度為0.5mg/mL時，WPS－1－1 對·OH 清除為30%，當濃度上升至3mg/mL時，其·OH清除率達到92%。前期實驗已證明海帶多糖低鹽粗組分具有自由基清除活性，其對和·OH的最大清除率分別為70%和80%［8］。由此可見，隨著海帶多糖純度的提高，多糖的自由基清除活性逐漸增強。本實驗測得WPS－1－1對和·OH的IC50分別為0.35和1.0mg/mL，而 VC對的IC50則小于0.1mg/mL，對·OH 的 IC50為 1.81mg/mL。

海藻多糖構效關系研究結果表明，多糖的分子量、硫酸根含量、糖醛酸含量和巖藻糖含量等都與其自由基清除活性有關［14－16］。其中，巖藻糖是海藻多糖主要的結構組成。研究發現，巖藻糖含量越高的海藻多糖，其自由基清除活性越強［17］。由單糖組成分析結果可知，海帶多糖純化組分WPS－1－1主要由巖藻糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，其中巖藻糖含量達到50%，表明WPS－1－1巖藻糖含量可能是影響其自由基清除活性的主要因素之一。此外，紅外光譜分析結果顯示，WPS－1－1還含有活性基團硫酸基，但其對WPS－1－1自由基清除活性的影響仍有待于進一步研究。

圖5 WPS－1－1自由基清除活性Fig.5 Scavenging effects on free radicals of WPS－1－1

3 結論

本實驗純化獲得的多糖組分WPS－1－1是分子量為112ku的雜多糖，主要由巖藻糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，其摩爾比為 6.9∶3.3∶1.5∶1。紅外光譜分析結果表明，WPS－1－1含有硫酸基，并以β－吡喃糖苷鍵為主要鍵型。體外清除自由基活性評價結果表明，WPS－1－1 對和·OH均有較好的清除活性，尤其是對·OH清除活性尤為顯著。海帶多糖純化組分WPS－1－1是天然活性多糖，具有良好的生物相容性，其顯著的清除自由基活性使其成為功能性自由基清除劑開發的優質資源。

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