氣體二氧化氯對黃曲霉的抑菌效果研究

楊 莎，白小龍，晉日亞，* ，陜 方，郭凱旋，牛浩剛，吳衛東

(1.中北大學化工與環境學院，山西太原030051;2.山西農科院農產品加工研究所，山西太原030031)

谷類農作物極易感染黃曲霉菌而發霉變質，尤其是玉米小麥等常食農作物。據報道全世界每年至少有2%的谷物因污染黃曲霉而報廢。由于黃曲霉危害嚴重［1］，對其的抑菌研究也不勝枚舉，國內外學者對黃曲霉的抑菌研究集中在物理方法抑菌［2-3］和生物制劑抑菌［4-6］方面，此類方法雖然能起到較好的抑菌防霉效果，但成本較高，尤其是生物制劑，很難滿足工業需求?；瘜W抑菌法尚停留在對防霉劑的研究上，傳統的防霉劑效果不甚理想且大多數存在安全隱患。二氧化氯作為聯合國世界衛生組織(WHO)確認的A1 級殺菌消毒劑，以其良好的擴散性、穿透性［7］和易降解、無殘留［8］的特點，已經在眾多領域得到了廣泛應用［9-10］。本實驗嘗試進一步拓寬其應用領域，采用氣體二氧化氯為殺菌防霉劑，對谷物表面的黃曲霉菌進行抑菌效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉菌(Aspergillus flavus) 購于山西大學生物工程系;黃曲霉菌載體 選擇易于感染黃曲霉菌的農作物玉米、小麥和小雜糧甜蕎、苦蕎，由山西農科院提供，選擇顆粒飽滿，無蟲蛀現象的樣品作實驗樣品;馬鈴薯瓊脂培養基(PDA) 馬鈴薯去皮，稱取200g、切成小塊，加蒸餾水煮沸30min，2 層紗布過濾，再加20g 葡萄糖和20g 瓊脂定容至1000mL，于高壓滅菌鍋內滅菌20min。取出后制作平板，冷卻后貯存備用;自制純度為97.3%的高純度二氧化氯氣體、葡萄糖(分析純) 天津市江天化工技術有限公司;瓊脂粉(生化試劑)、氯化鈉(NaCl，分析純) 天津市大茂化學試劑廠;無水乙醇(分析純) 天津市北辰方正試劑廠。

ESJ200-4 型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司;BJ-2CD 型凈工作臺、YXQ-LS-18S1 型自動手提式滅菌器、SPX-250B-Z 型電腦生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;2DHW 型電熱套 北京中興偉業儀器有限公司;JB-3 型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷滋新涇儀器有限公司;UV-9600 型紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃曲霉菌載體的接種 稱取玉米，小麥，甜蕎和苦蕎各80g 并清洗晾干。取黃曲霉的活化斜面若干，在無菌操作條件下，用經過灼燒的接種環將淹沒在1mL 滅菌蒸餾水中的黃曲霉菌落從活化斜面的培養基上刮下來，倒進裝有谷物的燒杯中，菌懸液的量以浸沒谷物為準。充分攪拌，濾去菌液，晾干待用。

1.2.2 抑菌實驗設計 根據黃曲霉抑菌的有關文獻以及預實驗總結，設計二氧化氯抑菌濃度、抑菌時間為主要實驗因素，對二氧化氯濃度和抑菌時間進行單因素實驗，確定水平區間。

1.2.2.1 二氧化氯抑菌濃度測試 稱取染菌小麥6份，各5g，置于六個殺菌消毒柜中，分別接入二氧化氯氣體發生儀，在抑菌時間40min 的前提下，研究二氧化氯濃度對抑菌率的影響。因低濃度二氧化氯既可高效殺菌又可避免殘留，設置濃度梯度為0.5、4.5、8.5、12.5、16.5、20.5mg/L 為宜。

1.2.2.2 抑菌時間的測試 稱取染菌小麥6 份，各5g，置于六個殺菌消毒柜中，接入二氧化氯氣體發生儀，控制抑菌濃度為12.5mg/L，研究抑菌時間對抑菌率的影響。抑菌時間梯度設置為5、10、20、30、40、50、60min 為宜。

1.2.2.3 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上，以抑菌率為主要考察指標，利用正交法，選擇二氧化氯濃度、抑菌時間和黃曲霉的載體類別為考察因素，每個因素設置四個水平，選用L16(45)因素水平表安排正交實驗，正交實驗設計水平因素見表1 所示。

表1 正交實驗的因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 菌懸液制備 將經過二氧化氯殺菌的谷物置于裝有50mL 帶轉子的生理鹽水錐形瓶中，調節磁力攪拌器轉速為1000r/min，充分離心30min，使得附著于谷物表面的霉菌孢子盡量都溶于生理鹽水中，制成菌體濃度為105CFU/mL 以上的均勻菌懸液。

式中，N0表示處理前菌體的數量，N1表示處理后菌體的數量。

2 結果與分析

2.1 二氧化氯對黃曲霉菌的抑菌濃度單因素實驗

由圖1 所示，隨著二氧化氯濃度的增加，抑菌率逐漸增加，在濃度達到8.5mg/L 時，抑菌率已經達到97.37%，繼續增加二氧化氯濃度，抑菌率雖還呈現增長趨勢，但增幅很小。這是由于當二氧化氯濃度達到8.5mg/L 時，對負載于小麥表面的黃曲霉的抑菌效果已經趨于最大值了，小麥表面剩余的少量黃曲霉菌為抗性很強的個體，殺滅較困難，所以繼續增加二氧化氯濃度對抑菌率的影響不大。由于黃曲霉載體對抑菌率可能存在很大影響，所以選擇二氧化氯濃度區間范圍為4.5、8.5、12.5、16.5mg/L 為宜。

圖1 二氧化氯濃度對抑菌率的影響Fig.1 Effect of concentration of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

2.2 二氧化氯對黃曲霉菌的抑菌時間單因素實驗

由圖2 所示，隨著抑菌時間的延長，抑菌率增幅明顯，當抑菌時間達到30min 后，抑菌率趨于平穩，并在30min 時抑菌率為最大值，繼續延長抑菌時間對抑菌率影響很小了，考慮其原因可能為在30min，氣體二氧化氯已經將絕大部分的黃曲霉菌致死，存活的少量菌種生命力較強，不易致死。繼續延長殺菌時間沒有意義。所以選擇二氧化氯抑菌時間為10、20、30、40min 為宜。

2.3 正交實驗結果與分析

按照L16(45)設計正交實驗表，正交實驗結果見表2 所示。

為了進一步探究實驗因素對實驗結果影響的顯著性，進行了實驗結果的方差分析，見表3。

表2 L16(45)正交實驗結果及極差分析表Table 2 Result of L16(45)orthogonal test and range analysis

表3 正交實驗結果方差分析表Table 3 Result of orthogonal analysis of variance

圖2 二氧化氯抑菌時間對抑菌率的影響Fig.2 Effect of the action time of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

根據表2 極差分析可得，二氧化氯對黃曲霉的抑菌最佳條件為:A4B4C4，即氣體二氧化氯抑菌濃度為16.5mg/L，抑菌時間為40min，黃曲霉載體為苦蕎，此條件下的抑菌率高達99.99%。從表3 中方差分析可以看出，霉菌載體對抑菌率具有顯著性影響，抑菌時間次之，抑菌濃度的影響不顯著。而當霉菌載體為苦蕎時，在正交實驗表中，4、10 號實驗得到的結果均為99.99%，就能量消耗考慮，優于正交實驗優化出的條件，其中4 號實驗抑菌時間較長，10 號實驗抑菌濃度較高，以經濟有效、合理利用、效率最高為原則，選擇4 號實驗條件，即氣體二氧化氯抑菌濃度為4.5mg/L，抑菌時間為40min，黃曲霉載體為苦蕎作為最優工藝條件。玉米和小麥作為易感染黃曲霉的糧食作物，當抑菌時間為40min 時，抑菌率也均高于90%。

3 結論

采用平板涂布法，評價氣體二氧化氯對谷物表面黃曲霉的抑菌效果，以抑菌濃度、抑菌時間和黃曲霉菌的載體為實驗因素，以抑菌率為指標，設計了L16(45)正交實驗，得到以下結論:氣體二氧化氯對黃曲霉的抑菌效果顯著，最佳抑菌工藝為:當霉菌載體為苦蕎時，氣體二氧化氯濃度為4.5mg/L，抑菌時間為40min，抑菌率達到99.99%。通過正交分析得，三因素的影響顯著性主次順序為載體類別、抑菌時間、抑菌濃度。

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