Ⅱ型膠原纖維α1基因（COL2A1）在視網膜脫離中的作用的研究進展

陳王浩 陳浩宇

視網膜脫離（Retinal detachment,RD）是一種嚴重的致盲性疾病，是指視網膜神經上皮與色素上皮分離。根據其病理機制的不同可分為孔源性視網膜脫離、牽拉性視網膜脫離和滲出性視網膜脫離三種類型，但視網膜脫離的分子遺傳學機制目前尚不太清楚。近20年來，絕大多數與視網膜脫離相關的分子遺傳學研究成果均來自針對伴有視網膜脫離的綜合征的研究。其中Ⅱ型膠原纖維α1 基因（COL2A1）與視網膜脫離的關系是當前研究的熱點。

1 COL2A1基因及其編碼產物

1.1 COL2A1基因：COL2A1全稱為Ⅱ型膠原纖維α 1，位于12 號染色體的長臂12 q 13.11 上，共包含31538 個堿基對，包括54 個外顯子。COL2A1編碼Ⅱ型膠原蛋白前肽，這些Ⅱ型膠原蛋白前肽從細胞內分泌到細胞外基質中，最終組裝成“纖維”狀的成熟的Ⅱ型膠原蛋白。

1.2 Ⅱ型膠原蛋白：Ⅱ型膠原蛋白是一種同源三聚體結構，由三個折疊成棒狀三股螺旋α多肽鏈組成。Ⅱ型膠原蛋白分布在人類的軟骨、眼的玻璃體，以及鈣結合蛋白的細胞外間隙及細胞外基質中；其在軟骨組織中最常見，而在玻璃體視網膜組織中僅有少量分布。

1.3 Ⅱ型膠原蛋白的結構特點及其分泌過程[1]

1.3.1 Ⅱ型膠原蛋白的結構特點：膠原的基本定義包含2個要素：（1）包括多個以Gly-X-Y模式重復排列的氨基酸序列（Gly代表甘氨酸，X通常代表脯氨酸，Y通常代表4-羥脯氨酸）；（2）這些重復排列的Gly-X-Y氨基酸序列必須要擁有3 條鏈形成3 股螺旋結構的潛在能力。COL2A1基因第1-5 外顯子編碼Ⅱ型前膠原蛋白的N端,第6-48 外顯子編碼三螺旋結構的核心區,第49-52 外顯子編碼C端。這3 條多肽鏈折疊成一個桿狀的3 股螺旋分子。構成膠原分子3 股螺旋結構的每條鏈以左手螺旋的方式延長，每圈包括3 個氨基酸。每條鏈都叫做α鏈。甘氨酸是最小的氨基酸，而這些氨基酸序列以Gly-X-Y的方式排列，這樣甘氨酸就可以處于有利位置，使3 條α鏈連接在一起。這個特點對維持大分子結構的穩定性非常重要。

1.3.2 Ⅱ型膠原蛋白的生物合成過程：Ⅱ型膠原蛋白的生物信息從COL2A1基因轉錄到mRNA上，mRNA被轉運到細胞質的粗面內質網，在粗面內質網mRNA進行翻譯；肽鏈的起始和延長從mRNA的羧基末端到氨基末端進行（即從C端到N端）；在肽鏈延長的過程中，“Y”位置的4-羥脯氨酸被羥化酶轉變為5-羥脯氨酸。只有形成螺旋結構的肽鏈才能被羥化修飾，這樣留下了大概200～300 個氨基酸殘基未被羥化修飾，3 股鏈的每條鏈的羥基末端前肽與自身相折疊，并通過鏈間二硫鍵固定。各條鏈之間通過羥基末端前肽和鏈間的二硫鍵連接起來。一旦3 條鏈通過羥基末端連接起來，3 聚體就開始向氨基末端（N'端）增值延長。3 聚體組裝完成后，通過高爾基體被分泌到細胞外間隙。在細胞外間隙中，3 聚體去掉N端和C段延長物，成為成熟的Ⅱ型膠原蛋白，并再次經過組裝成為纖維狀。COL2A1發生突變時可導致Ⅱ型膠原蛋白結構變性或分泌異常，最終導致相關疾病的發生。

2 COL2A1基因突變合并視網膜脫離的相關疾病

Ⅱ型膠原蛋白廣泛分布在人類的軟骨、眼的玻璃體中，COL2A1基因突變多引起全身系統性疾病，部分疾病合并視網膜脫離。目前已發現的COL2A1基因突變可引起的疾病有：軟骨成長不全、Stickler綜合征、Kniest脊柱骨骺發育不良綜合征、輕度軟骨發育不良的骨關節炎、先天性脊椎骨骺發育不良、Strudwick類型先天性脊椎骨骺發育不良、spondyloperipheral 發育不良、platyspondylic lethal skeletal dysplasia、原始股骨頭壞死、家族遺傳性孔源性視網膜脫離、Ccruch發育不良跖骨類型。其中4種疾病出現視網膜脫離的臨床表現：Stickler綜合征、Kniest 脊柱骨骺發育不良綜合征、家族遺傳性孔源性視網膜脫離、馬歇爾綜合征（Marshall 綜合征）。

2.1 Stickler綜合征：也稱作關節眼?。╝rthro-ophthalmopathy），是一種常染色體遺傳性結締組織疾病，是由編碼不同膠原蛋白的基因突變引起的。臨床表現以眼、耳、關節、骨骼系統的病變為特點，包括高度和進展性近視伴有玻璃體液化和視網膜脫離，進展性的神經性聽力下降，腭裂，下頜骨發育不全以及骨關節疾病。該病具有高度的臨床異質性，可分為5 種亞型，分別由COL2A1、COL11A1、COL11A2、COL9A1、COL9A2五個基因突變所引起。其中1 型Stickler綜合征，臨床表現以眼部病變為主要特征，全身癥狀較輕微。其余四種類型均伴有不同程度的全身其他系統的癥狀。

Stickler于1965年首次報道大多數Stickler綜合征患者攜有COL2A1基因突變[2]。該研究顯示COL2A1基因突變可以導致眼部、顱面部、聽力系統、骨關節系統臨床癥狀。但Stickler沒有發現究竟是哪些突變會導致眼部疾病。Ahmada于1991年發現了一個位于COL2A1上的基因突變，該突變僅針對眼部組織（全部6 名家系成員都有視網膜脫離，而全身癥狀相對輕微甚至于無）[3]?？梢哉J為該突變是第一個被發現的可導致視網膜脫離的基因突變。該突變位于基因序列al-732 位點，為單個堿基突變（胞嘧啶突變為胸腺嘧啶，C→T）,使氨基酸密碼子由CGA轉化為TGA。TGA是一個終止密碼子，導致基因轉錄和翻譯的過程提前終止，所生產的多肽鏈被縮短。而這種變短的多肽鏈是無法參與Ⅱ型膠原纖維的合成的。顯然，這種位于COL2A1基因上的沉默突變可以導致Ⅱ型膠原蛋白的生成量減少。

2.2 Kniest發育障礙：Kniest發育障礙是一種常染色體遺傳疾病，主要臨床表現為：侏儒癥，聯合腭裂、聽力缺陷、近視、視網膜脫離等癥狀。該病的遺傳學研究報道較少，被研究的家系也較少。目前該疾病的遺傳學研究表明，編碼Ⅱ型膠原蛋白的COL2A1基因突變是其致病原因[4-6]。這3 篇報道均提示COL2A1基因的雜合突變，導致Ⅱ型膠原蛋白單倍劑量不足是導致疾病的發生原因。

2.3 家族遺傳性孔源性視網膜脫離：Richards分別于2002年和2005 在多個家族遺傳性孔源性視網膜脫離家系中確定該病與COL2A1基因突變有關。其中一篇文章找到一個位于COL2A1基因外顯子上的突變[7-8]。而更令人感興趣的是2003年一篇報道發現一個家族遺傳性孔源性視網膜脫離家系的突變位于COL2A1基因2 號外顯子上的突變[9]。而COL2A1基因2 號外顯子上的突變已被多篇報道認為是與1 型Stickler綜合征的基因突變緊密相關的。

2.4 其他：馬歇爾綜合征（Marshall 綜合征）也可以導致視網膜脫離。某些病例報告其也是由COL2A1基因突變所導致的[10]。

3 COL2A1基因突變與視網膜脫離的相關研究的進展

3.1 COL2A1基因突變導致的Ⅱ型膠原蛋白單倍劑量不足理論:位于COL2A1基因上的突變導致終止密碼子的提前出現，基因轉錄和翻譯的過程提前終止，所生產的多肽鏈縮短，Ⅱ型膠原蛋白的生成量減少，最終導致全身結締組織病變、眼部病變及視網膜脫離。該理論被多篇文獻所證實。

例如：Ahmada于1991年發現了一個位于COL2A1上的基因突變,該突變僅針對眼部組織（全部6 名家系成員都有視網膜脫離，而全身癥狀相對輕微甚至于無）[3]?？梢哉J為該突變是第一個被發現的可導致視網膜脫離的基因突變。該突變位于基因序列al-732 位點，為單個堿基突變（胞嘧啶突變為胸腺嘧啶，C→T）,使氨基酸密碼子由CGA轉化為TGA。TGA是一個終止密碼子，導致基因轉錄和翻譯的過程提前終止，所生產的多肽鏈被縮短。而這種變短的多肽鏈是無法參與到Ⅱ型膠原纖維的合成的。顯然，這種位于COL2A1基因上的沉默突變可以導致Ⅱ型膠原蛋白的生成量減少。

Ahmad隨后在1995年發現了另一個Stickler綜合征家系的COL2A1基因突變。該突變位于COL2A1基因的第50 號外顯子上。單個堿基缺失，導致終止密碼子提前出現，致使COL2A1所合成的C前肽鏈比正常至少減少84 個氨基酸殘基，從而導致基因的功能產物不足[11]。

Korkko于1993年對一個臨床表現主要為眼部癥狀的Stickler綜合征家系(早發白內障、視網膜格子樣變性、視網膜脫離)進行COL2A1基因突變關聯性研究，其結論表明：該家系突變位于COL2A1基因10 號外顯子，基因序列α1-67 位點上的單個堿基替換（由鳥嘌呤轉化為腺嘌呤，即G→A），使密碼子由甘氨酸轉（GGT）變為天冬氨酸（GGT）。與其他關于研究的報道進行對比后，Korkko認為：COL2A1基因突變導致提前終止密碼子的產生，是大多數Stickler綜合征患者的發病機制，且該機制同時適用于眼部癥狀和其他系統癥狀[12]。

2002年Donoso,L.A.的研究小組在一個大的Stickler綜合征家族（2384 名家族成員，跨度達8 代）中發現并確定了一個在COL2A1基因的2 號外顯子上的C→A突變，該突變導致終止密碼子的提前出現[13]。

2010年一篇文獻報道[14]：一個來自歐洲的研究小組，對過去10年188 名臨床診斷為Stickler綜合征的患者（包括各種亞型）的COL2A1基因進行了突變掃描和雙向熒光DNA測序分析。他們在其中100 名患者的COL2A1基因上找到了77 種不同的突變。分析表明這些突變基因均有異常類型RNA存在，且大多數含有提前終止密碼子。在COL 2 A基因突變小組的病人中玻璃體異常和視網膜脫離較無突變小組高（P＜0.01）。其中散發的23 例COL2A1突變病人中有20 人臨床表現為同時有顎裂和視網膜脫離。該研究認為當患者同時有視網膜脫離、或視網膜裂孔、或玻璃體異常，和腭裂癥狀，并且有陽性家族史時，往往提示患者存在COL2A1基因突變。

上述研究表明，COL2A1基因突變導致的單倍劑量不足在伴隨視網膜脫離的綜合征中非常普遍。

3.2 COL2A1基因突變的類型：突變導致COL2A1基因功能失活的機制據目前報道常見的主要有3 種：沉默突變、錯意突變、框移突變。這3 種突變分別通過不同的分子機制導致COL2A1基因功能失活。其中又以沉默突變導致的COL2A1功能缺失最常見[14]。其他類型基因突變較少見，如2000年Richards在1 個Stickler綜合征家系中發現了另一種COL2A1基因突變，這個獨特的L 467 F突變可以改變Gly -XY三螺旋區域的X位置的氨基酸，導致“無膠原纖維玻璃體”[15]。

3.3 COL2A1基因不同位置突變可導致不同臨床表現，位于COL2A1基因的外顯子的突變多與視網膜脫離相關[8,16]。2000年Richards,A.J對8 個Stickler綜合征家系和Wagner 綜合征家系的研究中發現，其中3 個家系基因突變在COL2A1基因的2 號外顯子上，其臨床癥狀主要集中在眼部（包括玻璃體視網膜病變和視網膜裂孔、視網膜脫離），而全身癥狀很輕微甚至沒有系統性癥狀。而其他5 個家系的突變出現在COL2A1的其他區域，癥狀表現為眼科癥狀，外加顱面部、關節、聽力等方面的疾病。該結果提示：COL2A1的2 號外顯子的突變可能直接導致眼部視網膜玻璃體病變[17]。

3.4 雖然已明確COL2A1基因突變可導致上述3 種綜合征，但由于沒有確定的基因突變位點，所以常規基因診斷仍有困難。Ahmad在1996年發明了一種利用PCR技術檢測患者是否攜帶有COL 21 A基因突變的技術[18]。利用該技術的目的是在當某一個Stickler綜合征家系的其他成員已經表現出明顯的臨床表現，而當其最小的嬰兒尚未表現出臨床癥狀或無法接受眼科檢查時，可以利用該技術從其外周血白細胞中提取DNA，檢測是否攜帶特定的COL2A1基因突變序列。該方法在一Stickler綜合征的3 代家系研究中獲得了成功。但該方法只是檢測某個特定的COL2A1基因序列，而已被發現的位于COL2A1基因上與Stickler綜合征相關的突變有多個，因此，該技術無法得到廣泛的應用。2011年Yaguchi改進了該技術[19]，但仍然只能檢測單個特定的COL2A1基因突變。

3.5 動物模型：2006年Kaarniranta的研究小組，對單個COL2A1等位基因失活的小鼠（COL2A1(+/-) mice）的眼睛進行組織學分析，發現其與人類Stickler綜合征患者眼睛的結構缺陷相類似[20]。

基于這個發現，Ahmada提出一個有趣的問題：既然Ⅱ型膠原纖維在眼組織中含量很少，而在結締組織中含量非常多，為什么這種突變卻會導致嚴重的眼科疾?。ㄒ暰W膜脫離導致的嚴重視力缺損），而其他富含2 型膠原蛋白的組織卻相對病變輕微？因此，Ahmada認為，雖然Ⅱ型膠原蛋白在眼中含量很少，但其生理功能非常重要。需要對人眼中的Ⅱ型膠原蛋白做更進一步的研究。然而，由于很難從病人的眼中提取組織，且膠原蛋白在體外的培養增殖非常困難，這個問題至今仍然沒有得到很明確的解決。

3.6 COL2A1基因突變造成Ⅱ型膠原蛋白數量不足的分子機制：Snead在1996年根據其對1 型Stikler綜合征的研究進行了較為合理的總結[1]：各種COL2A1基因堿基序列上的錯意、刪除、框移等突變，導致終止密碼子的提前出現，從而導致基因的轉錄和翻譯的重復排列的Gly-X-Y氨基酸序列縮短。這些被縮短的重復排列異常序列與正常序列形成的雜合3 聚體，在粗面內質網中無法被組裝為正常的3 聚體結構(這些異常序列將會與正常序列形成雜合3 聚體)，從而導致所形成的異常蛋白質無法從粗面內質網轉運到高爾基體中去。也許會有少部分這種異常結構的蛋白質會被轉運到高爾基體中，但因為同樣的原因仍然無法被分泌到細胞外間隙。同時還會有部分正常的Gly-X-Y氨基酸序列形成，這部分正常的氨基酸序列會沿著粗面內質網→高爾基體→細胞外間隙的正常途徑在細胞外形成正常的Ⅱ型膠原蛋白。雜合3聚體與正常3 聚體的比例大概是1∶3。因而導致Ⅱ型膠原蛋白分泌的劑量不足。最終導致眼部的玻璃體視網膜病變。那些無法從粗面內質網膜表面轉運出去的異常蛋白質，保存在包涵體中，最終被溶酶體所消化。

該理論較好的解釋了COL2A1上的基因突變，造成Ⅱ型膠原蛋白分泌的劑量不足的病理機制。但無法解釋為什么同樣是Ⅱ型膠原蛋白分泌的劑量不足,在眼部的癥狀十分明顯，而在全身其他系統（如骨骼、耳）病變較輕。

4 小結與展望

近20年來對于1 型Stikler綜合征，以及可導致視網膜脫離的疾?。ò↘niest 發育障礙、家族遺傳性孔源性視網膜脫離）的家系及相關基因研究，多發現視網膜脫離與編碼Ⅱ型膠原蛋白的COL2A1基因突變有關。而對于其發生的具體病理機制，還需要更進一步的研究。

上述研究表明，COL2A1基因突變可導致多種遺傳性視網膜脫離綜合征。對大多數散發視網膜脫離患者的臨床意義不大。未來可以做進一步研究，探索COL2A1基因突變與常見的散發視網膜脫離是否存在相關性。

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